黃曲霉毒素一般檢測方法概述

　　【薄層色譜法】

    1.薄層層析(TLC)法

    TLC法是測定黃曲霉毒素的經典方法，在薄層板展開后，在365 nm紫外燈下，黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2分別顯示紫色、藍紫色、綠色和綠色熒光。TLC法的特異性較差，靈敏度相對較差，且測定黃曲霉毒素專一性不夠，經常引起測量誤差。但由于此法設備簡單，易于普及，所以國內外仍在使用。

　　2.高效薄層(HPTLC)法

    HPTLC法測定黃曲霉毒素采用目前國際上流行的樣品處理方法——固相萃取法(SPE)中針對真菌和病毒的多功能凈化(MFC)柱。采用MFC柱凈化后，僅用單相展開即可達到分離測定的目的，不僅節省了工作時間，提高了工作效率，而且進一步減少了有毒有害溶劑的用量。Stroka等將免疫親合柱凈化應用于TLC法測定，進行單相展開并用熒光密度計定量，此方法能檢測含量明顯低于當前歐盟標準的黃曲霉毒素。Kamimura等用HPTLC方法測定玉米、花生、蕎麥等樣品，并與通過公職分析化學家協會(AOAC)認證的分析花生及花生制品中黃曲霉素的方法CB(Contamination Branch)法和BF(Best Foods)法進行比較，4種主要黃曲霉毒素的檢測限均不高于0.2μg／kg，回收率與CB法一樣均高于BF法。

　　3.高壓薄層色譜(OPTLC)法

    高壓薄層色譜于1979年由Tyihak提出，它結合了經典薄層色譜法、高效薄層色譜法與高效液相色譜法的優點，是一種能夠提高薄層分離效率的平面液相色譜技術。隨著實驗技術的不斷成熟，OPTLC法在飼料和食物中黃曲霉毒素的檢測方面的應用越來越多。Eszter Papp等發展了一系列適合檢測玉米和小麥中黃曲霉毒素的OPTLC方法。

　　【高效液相色譜(HPLC)法】

    由于具有穩定、準確、靈敏等優點，HPLC法已成為當前進行黃曲霉毒素定量研究的首選方法。分析黃曲霉毒素的液相色譜方法包括正相液相色譜方法(NPLC)和反相液相色譜方法(RPLC)。反相高效液相色譜(RP-HPLC)系統易操作，流動相具有低毒性，可同時分離、分析樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受樣品沸點、熱穩定性、和分子量限制，所以目前使用熒光檢測器的反相HPLC法已經成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法。Chiavaro等根據不同環式糊精增強黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1熒光釋放的不同效果，發展了將環式糊精加入到流動相中的高效液相色譜法，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢測限均在0.3μg／kg以下，M1的檢測限在0.0005μg／kg以下，幾種黃曲霉毒素都呈線性反應關系。這種方法也被用于測定自然污染及人工添加樣品。

　　【免疫學方法】

    黃曲霉毒素的免疫學檢測方法是將生物大分子的免疫學特性與化學特性結合起來的檢測方法。該方法具有快速、靈敏、對樣品純度要求不高的特點，特別適合于大批量樣本的檢測。用于檢測黃曲霉毒素的免疫學方法有酶聯免疫吸附測定法、放射免疫測定法、親和層析法、熒光偏振免疫測定法及免疫層析法。

　　1.酶聯免疫吸附測定(ELISA)法

    ELISA法是在免疫學和細胞工程學基礎上發展出來的一種微量檢測技術，分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法，其優點是對黃曲霉毒素B1的檢測定性定量準確而且檢測速度快(比薄層法提高了近200倍)，特異性強，熒光物質、色素、結構類似物對結果無干擾，回收率高，提取方法簡單，成本較低，特別適合于對黃曲霉毒素Bl污染監測控制中大量樣品的篩查。缺點是ELISA法中酶的活性易受反應條件影響，測定結果重復性較差，測定結果易出現假陽性問題；此外ELISA試劑壽命短，需要低溫保存，葡萄酒類、含鹽量高的醬油、含脂量高的花生油在提取時要進行調節pH值、脫鹽、脫脂等特殊處理。

　　2.親和層析法

    親和層析法利用免疫化學反應原理，采用大劑量的單克隆抗體，選擇性吸附提取液中的抗原物質黃曲霉毒素。由于抗原-抗體反應具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點，從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測靈敏度，同時可顯著減少有毒有害試劑的使用，有利于操作人員的身體健康和環境保護。

　　3.放射免疫(RIA)法

    RIA法與ELISA法基本相似，不同的是它們所使用的標記物不同，ELISA法的標記物為酶，RIA法所用的標記物一般為放射性元素氚(3H)。該方法是將毒素-3H標記物與樣品加抗體進行競爭性結合，除去未結合的部分，測定其放射性，放射性強則說明樣品中毒素含量低，反之毒素含量高。實驗證明ELISA比RIA靈敏度更高且更簡便，并且RIA需要特殊設備，有放射性元素污染問題，人員需要安全防護，現在已經很少使用。

　　4.熒光偏振免疫測定法

    熒光偏振免疫測定法的主要原理是熒光標記的毒素在樣品緩沖液中與未熒光標記的毒素對特異性抗體的競爭性結合。分子質量越大，分子旋轉速度越慢，熒光偏振值越大。Nasir等報道了用基于熒光偏振的裝置檢測不同谷物中的黃曲霉毒素。

　　5.免疫層析(IC)法

    IC法是20世紀80年代初發展起來的一種快速免疫分析技術，其操作簡單，快速，人員不用培訓，且不需特殊的儀器設備，非常適用于現場測試和進行大量樣品的初篩。免疫學與儀器結合方法