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１．帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制酶進行消化可以產生帶有非互補突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數質粒載體均帶有由幾個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點。由于現有的多克隆位點如此多樣，因而幾乎總是能找到一種帶有與外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位點的載體。于是，采用所謂的定向克隆即可將外源ＤＮＡ片段插入到載體當中。例如：載體pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ進行消化，然后，通過凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段，以使同芤下來的多克隆位點 缺小片段分開。于是，這一載體就可以同有與BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ區段相連接。用得到的環狀重級體化大腸桿菌，檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補，載體片段不能有效地環化，所以轉化大腸桿菌的效率也極低。因此，大多數具有氨芐表霉素抗性的細菌都含有帶外源ＤＮＡ區段的質業，外源ＤＮＡ區段成為連接HindⅢ和BamHI位......閱讀全文
連接反應的策略 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：──────────────────────
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人
NA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。主要用于（1）外源性基因轉染；（2）對外源性基因的轉化分離。實驗方法原理限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；
基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認識和閱讀載體圖譜吧。 一、載體分類及載體組成元件 載體分類 1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體 病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目
基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認識和閱讀載體圖譜吧。 一、載體分類及載體組成元件 載體分類 1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體 病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目的細
實驗概要本技術以pBS質粒、E. coli DH5α為例介紹了重組質粒的連接、轉化及篩選。實驗原理本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS，轉化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。因pBS帶有Amp
病毒載體 經典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣，效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結歸納如表一。 表一：六大病毒載體技術的比較 載體 感染廣譜性 靶細胞類型 表達形式 表達時間 免疫原
病毒載體經典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣，效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結歸納如表一。表一：六大病毒載體技術的比較 載體感染廣譜性靶細胞類型表達形式表達時間免疫原性外源片段容量(Kb)滴度(TU/ml)缺點腺病毒載體高分裂
克隆法 實驗方法原理 限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA
重組DNA是在體外用限制性內切酶，將不同來源的DNA分子進行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體重新連接，從而組成一個新的DNA雜合分子。重組的DNA分子能夠通過一定的方式進入相應的宿主細胞，在宿主細胞中進行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段，此過程稱基因克隆。重組的DNA分子也能夠在
材料、設備及試劑 一、 材料 外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。 二、 設備 恒溫搖床，臺式高速離心機，恒
第二節 材料、設備及試劑一、 材料外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA : pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。二、 設備恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋
（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 一、試劑準備 1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細
連接反應（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應 外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口，當雜本導
（3）插入表達篩選法與插入失活相反，插入表達法是外源目的基因插入特定載體后，能激活用于篩選操作的標記基因的表達，由此進行轉化子的篩選。設計載體時，在篩選標記基因前面連接一段具有抑制作用的負調控序列，插入外源DNA將使該負調控序列失活，其下游的篩選標記基因才能表達。例如質粒pTR262有一個負調控的c
DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的片段進行重新，其目的在于對目的進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞的基本過程包括：(1)目的片段和載體的制備； (2)目的片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。一、試劑準備1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用）
實驗概要所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。主要試劑1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用
目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。&n
當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。&nbs
原核表達系統是常被用來研究基因功能的成熟系統，由于原核表達系統具有包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整等缺陷，人們也開始利用真核細胞表達系統來研究基因。自上世紀70年代基因工程 技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發展，時至今
劉芝華 中國醫學科學院腫瘤研究所 分子腫瘤學國家重點實驗室 概念： 基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。 基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因
二、重組DNA分子轉入真核細胞1. 根癌農桿菌Ti質粒介導法農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法是目前研究最多、機制最清楚、技術方法最成熟的基因轉化途徑。迄今為止約8096的轉基因植株都是利用農桿菌介導轉化系統獲得的。農桿菌是一類土壤習居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，而對絕大多數單子葉
表達載體的構建是生物技術和所需蛋白質產生的基本工具，本文總結了pET-32α（+）載體技術的構建，該技術通常用于研究實驗室。該方法包括獲得用于構建載體的外源DNA片段，將DNA片段亞克隆到pET-32α（+）表達載體中，在大腸桿菌 BL21（DE3）中進行蛋白質表達以及在大腸桿菌中在天然條件下進
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定 第二章DNA 酶切及凝膠電泳 第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化 第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第五章重組質粒的連接、轉化及篩選 第六章基因組DNA 的提取 第七章RFLP 和RAPD 技術 第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆 第九章分
基因工程的主要目的是使優良性狀相關的基因聚集在同一生物體中，創造出具有高度應用價值的新物種。為此必須從現有生物群中，根據需要分離出用于克隆的此類基因。這類基因稱之為目的基因，即準備要分離、改造、擴增或表達的基因。目前目的基因的獲取方法主要有以下2類：（1）已知基因的獲得：PCR分離法和化學合成法等（
外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜