DNA連接試驗

當我們已經獲得目的基因片段，選擇好適當的克隆（或表達，轉化）質粒載體， 并確定重組方案后，下面要進行的就是ＤＮＡ片段之間的體外連接，從而獲得重組子。 此重組子可轉入相應的宿主菌中用于對目的基因的擴增以及目的基因表達（如現代基因工程藥物的生產），還可用于序列分析和轉基因等重要生物技術的研究中。

DNA連接實驗原理：

ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下， 由ＤＮＡ連接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程， ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的。

帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質粒都可能發生環化,也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使“正確”連接產物的數量達到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態細胞后可被修復。

不對稱粘性末端：兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。

對稱性粘性末端；線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中。

3、 平端：要求高濃度的DNA和連接酶；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；非重組克隆的背景較高 。

粘性末端連接：

實驗試劑：

用適當的限制酶消化質粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。

10×T4DNA連接酶buffer（該緩沖液應分裝成小份，貯存于－20℃。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫芐糖醇

500μl/ml BSA（可用可不用）
T4DNA連接酶% 
5mM ATP

實驗步驟：

1、 在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：

1) 10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1-1∶5），補足ddH2O 至8μl。
2) 輕輕混勻，稍加離心，于45℃水浴５分鐘使重新退火的粘端解鏈， 迅速將混合物轉入冰浴。
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl。

2、 蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心５秒。

3、 １２℃下過夜連接反應。

4、 反應結束后于－２０℃保存。

5、 再設立兩個對照反應，其中含有（１）只有質粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。

注意事項：

1、 連接反應的溫度：ＤＮＡ連接酶的最適反應溫度為３７℃，但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結合很不穩定，折衷方法是１２℃過夜。

2、 DNA的平未端和粘性末端：由于內切酶產生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的。

3、 堿性磷酸酶處理質粒載體：為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現ＤＮＡ自生連接問題， 為此通常選擇對質粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環化， 通過接反應后形成的缺口可在轉化細胞后得以修復。

4、 連接反應的檢測：連接反應成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。

5、 如果要檢驗連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效，可重新連接酶切后的λDNA。若連接成功，則說明有效。

平端DNA連接：

Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶不同于大腸桿菌ＤＮＡ連接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。

優點：

1、 沒有連不上的，只有切不開的。平末端連接不牽扯到粘性末端的堿基突出問題，所以，理論上任何兩條DNA序列都能連接在一起，當然需要ligase的酶學作用。這個不同DNA分子之間的連接帶來了極大地便利，因為平末端自然是這樣，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以經過處理成為平末端。

2、 有時候，兩個平末端連接在一起以后，可以產生另一種內切酶的識別序列，為后續的克隆工作提供了一種機會。

缺點：

1、 連接效率比粘性末端低：連接效率之所以比較低，原因之一是在連接過程中只有連接酶的作用，缺乏粘性末端那樣突出堿基的互補作用；原因之二是常用的T4DNAligase對于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2、 可能產生雙向插入：由于平端連接的末端沒有特異性，連接的時候不能定向，所以兩種方向的插入都有可能。這個時候就需要有一種有效的鑒定方法。一般分別在載體和目的片段選擇一個酶切位點進行酶切鑒定，當然，具體的鑒定方法要根據具體的實驗而定。

3、 可能多拷貝插入：平端連接時，可能目的片段多個插入，并且在多個插入的時候還有可能每個插入子以不同方向連接，導致有時候結果難以解釋。一般目的片段越大，多拷貝插入的可能就越小。

平端連接要求的條件：

1、 低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2、 不存在亞精胺一類的多胺。

3、 極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。

4、 高濃度的平端

實驗試劑：

凝聚劑：在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。

在連接反應中，這些物質具有兩作用：

1、 它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個數量級，因此可使連接反應在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進行

2、 它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利于自身環化（j:i=10）的ＤＮＡ濃度下，所有的ＤＮＡ產物也將是線狀多聚體

聚乙二醇（PEG8000）：

1、 用去離子水配制的ＰＥＧ8000貯存液（40％）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。在含15％PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于０℃混合，然后加適當體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20℃進行溫育。

2、 連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或ＭgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

3、 濃度為15％的PEG 8000可刺激帶粘端的ＤＮＡ分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產物是串聯的多聯體。4、 PEG 8000可刺激短至８個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。

氯化六氨合高鈷：

1、 氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

2、 在單價陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環狀ＤＮＡ將點盡優勢。

3、 與ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。

實驗步驟：(以20ul 酶切完后的體系為例）

1、 如果要補平或切平,先將樣品置于70度水浴10min,將體系放大到50ul，其中按照說明書加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等。

2、 常溫反應10min后將反應物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反應5min。

3、 凝膠回收處理的載體或片斷。

4、 CIAP處理。

5、 苯酚氯仿純化，最后乙醇回收。

6、 連接反應。

注意事項：
1、 插入片斷和載體片斷的比例要高。

2、 連接酶要加的多點，最好用高濃度的酶。

3、 載體片斷要做去磷酸化處理。

4、 也可以用15％的PEG8000來增加連接效率和減少載體自聯。

5、 反應體系10UL，不要太大。

6、 載體片斷不要加多了，一般酶切跑賋并割膠純化并去磷酸化后加0。5微升就可以了。

7、 去磷酸化的步驟要根據自己酶的性質而定，一般要反應一個小時，在反應半小時后再補充酶再反應半小時。

8、 插入片斷和載體片斷要酶切良好。