分子克隆介紹
各位小伙伴，大家還記得當初進實驗室的時候接觸到的一個實驗技能是什么呢？沒錯，是 PCR 擴增。小編曾經也是，看著自己親自配比 PCR 克隆擴增的每個組分，親眼看著瓊脂糖凝膠在紫外透光臺上發出的幽綠色的熒光，也是深深被迷住。但總不可能成天就對著這個邪魅的熒光發呆，對吧？看久了，她會愛上你的眼睛，把你眼睛據為己有的，說白了，就是眼睛看紫外看多了，瞎了。因此，小編也是不得不接著往下做著實驗，從此也展開了慢慢苦逼的生物科研道路。今天小編要來分享的可不是 PCR 擴增，相信在實驗室摸爬滾打飽經風霜的小伙伴閉著眼睛都知道怎么做。小編今天要給大家分享的是我們的第二個實驗技能。是的，你沒想錯，就是分子克隆實驗。可能這時候實驗室的老鳥會問，小編你講分子克隆有什么意思啊，這個實驗太基礎了，我閉著眼睛也會做，沒什么技術含量啊。可是小編想說，分子克隆作為實驗室的基礎實驗，相比于 NGS、Crisp9 這些高duan實驗確實簡單，甚至比......閱讀全文
分子克隆介紹
各位小伙伴，大家還記得當初進實驗室的時候接觸到的一個實驗技能是什么呢？沒錯，是 PCR 擴增。小編曾經也是，看著自己親自配比 PCR 克隆擴增的每個組分，親眼看著瓊脂糖凝膠在紫外透光臺上發出的幽綠色的熒光，也是深深被迷住。但總不可能成天就對著這個邪魅的熒光發呆，對吧？看久了，她會愛上你的眼
簡述分子克隆化克隆的選擇
①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，
分子克隆常用技術
一、核酸的純化 在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的純化。其關鍵步驟是去蛋白質，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進行下一步時，可進行這種抽提。然而，如要從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后
分子克隆常用載體
分子克隆常用載體 DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用
分子克隆的技術方法
在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。
分子克隆的常用載體
DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆
分子克隆（molecular－coloning）常用技術
一、核酸的純化在分子克隆 的所有操作中，最基本的操作是核酸的純化。其關鍵步驟是去蛋白質，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當需要把克隆 有某一些所用的酶滅活或去除以便進行下一步時，可進行這種抽提。然而，如要從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白
DNA分子克隆的幾個概念
在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecors）在細胞內自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而
分子克隆技術的特點
1. 有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆； 2. cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息； 3. cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。
分子克隆技術的簡介
克隆(clone,clon)一詞源于希臘文Klon，原意為樹木的枝條。在生物學中其名詞含義系指一個細胞或個體以無性繁殖的方式產生一群細胞或一群個體，在不發生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系；其動詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術將
分子克隆技術的應用
分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對于工業、農牧業和醫學產生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。 在醫學方面，利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞
分子標記基于圖譜克隆基因
圖位克隆(Map—bascd cloning））是近幾年隨著分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發展起來的一種新的基因克隆技術。利用分子標記輔助的圖位克隆無需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表達產物，就可以直接克隆基因。圖位克隆是最為通用的基因識別途徑，至少在理論上適用于一切基因。基因
分子克隆的常用載體介紹
DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主復制，即必須具備復制原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在復制原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆
分子克隆蛋白表達實驗指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the ? absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 &Arin
關于分子克隆化的基本介紹
分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對于工業、農牧業和醫學產生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。
分子克隆蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表達實驗指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions:????? 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH?? Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表達實驗指南（五）
8. TA質粒轉化菌落的驗證? 與表達載體的驗證不同，轉化TA質粒時不用雙酶切驗證。只需用目的基因引物和TA載體引物PCR驗證即可。TA載體引物PCR片段比插入片段大約長150bp。? 目的基因退火溫度與之前膠回收時溫度相同，TA退火溫度60C即可，但可在55～70之間變動，不會影響結果。? 挑取至
分子克隆蛋白表達實驗指南（四）
7. PCR產物與TA載體連接?? pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation ? efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.? +A s
分子克隆蛋白表達實驗指南（十一）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MarkerUII 37CUI’I’??????? Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul??????? UI：未誘導菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個??????? I：誘導后對照，上樣10ul??????? UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表達實驗指南（十四）
RbCl制備感受態細胞? 需準備的滅菌器具和培養液：? SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml ? EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰? 離心管，EP管，移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表達實驗指南（二）
取DEPC水時切記帶上手套?? ? Genequant使用方法：? 開機－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否為320nm)－set-ref(此時插入空白對照)－樣品? 1．使用前將比色皿中水吸出，用1ml蒸餾水重新洗滌再將比色皿中的水吸盡（先用1ml槍吸，后用100ul槍吸）
分子克隆蛋白表達實驗指南（七）
目的基因表達?? ?? 14．快速誘導表達? 快速誘導目的是為檢測該重組質粒在BL21中是否能被誘導表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導效率的差異。? 5．? 挑單克隆菌落于7ml含有相應抗生素LB培養液的50ml培養管中，37C振蕩培養過夜（8-16h）。? 6．? 37C，1mM ?
分子克隆蛋白表達實驗指南（一）
目的基因克隆包括保存用全長基因(gene for saving, GS)和表達用全長基因(gene for expression, GE)兩部分。? 這兩部分所克隆的基因都是全長片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精確克隆(及引物從基因CDS兩端開始)很難找到高效價的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表達實驗指南（十六）
Amp(50mg/ml)??????? 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養基，1:1000比例稀釋?????? ????? Kan(50mg/ml)??????? 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表達實驗指南（十九）
Desired? pH? Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL)????????????? 5.8? 8.591.5????????????? 6.0? 13.286.8????????????? 6.2? 19.280.8?????????
分子克隆蛋白表達實驗指南（十三）
7．? ? 電泳結束后，按比例從膠上割下相應約1cm條帶（當按比例的條帶割下后可相應的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。? 8．? 將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。? 9．? 移出放電透析tube的架子，
分子克隆技術的應用介紹
分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對于工業、農牧業和醫學產生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。在醫學方面利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素
分子克隆蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
