2023年度CRISPR基因編輯領域十大研究進展，張鋒實驗室遙遙領先

　　這項研究凸顯了CRISPR前所未有的多樣性和靈活性，也表明了大多數CRISPR系統是罕見的，只在不尋常的細菌和古細菌中發現。隨著可用來搜索數據庫的不斷增長，可能還有更多罕見系統被發現。

　　誕生于2012年的CRISPR基因編輯技術，可能是21世紀以來生命科學領域最受關注的科學突破。2020年，CRISPR基因編輯技術獲得諾貝爾獎的認可，而就在這個月，美國FDA批準了首款基于CRISPR的基因編輯療法上市，用于鐮狀細胞病（SCD）患者。這表明了CRISPR可以真正有意義地解決患者面臨的挑戰性問題。

　　如今，每年有數千篇CRISPR相關研究論文發表，轉座酶、Fanzor、表觀基因組編輯的加入，讓CRISPR工具箱不斷擴展；LNP、VLP等遞送工具的開發，以及微型化CRISPR系統的發現，讓體內基因編輯快速發展；基于CRISPR的基因編輯在各種疾病的臨床前和臨床研究中展示了巨大潛力...

　　在2023年結束之際，《生物世界》評選了2023年CRISPR基因編輯領域的十大研究進展（按論文上線時間排序，入選論文聚焦于基因編輯技術突破，不列入那些只是使用CRISPR作為基因編輯工具的論文）。這些研究進展包括了新型CRISPR系統開發、改造、治療應用、安全性研究等方向。

　　我們將張鋒團隊2023年6月28日發表于 Nature 期刊的論文評為年度論文，該研究首次在真核生物中發現CRISPR樣系統——Fanzor。

　　1、通過堿基編輯治療心臟病

　　2023年1月12日，德克薩斯大學西南醫學中心 Eric Olson 團隊在 Science 期刊發表了題為：Ablation of CaMKIIδ oxidation by CRISPR-Cas9 base editing as a therapy for cardiac disease 的研究論文。

　　該研究使用基于CRISPR-Cas9的腺嘌呤堿基編輯器（ABE），在小鼠模型上將CaMKIIδ的兩個甲硫氨酸（ATG）編輯為纈氨酸（GTG），阻止CaMKIIδ的過度激活，能夠保護心臟免受缺血-再灌注損傷的影響，促進心臟功能的恢復，減少永久性損傷，而且在心臟病發作后再進行治療也為時不晚，有望開發為一種適用于廣泛的心臟病患者的治療和保護方法。

　　2、首個口服CRISPR藥物，防治細菌感染

　　2023年5月4日，丹麥科技大學、基因編輯療法公司SNIPR Biome的研究人員在 Nature Biotechnology 期刊發表了題為：Engineered phage with antibacterial CRISPR–Cas selectively reduce E. coli burden in mice 的研究論文。

　　抗生素治療對人體腸道微生物群有不利影響，還會導致抗生素耐藥性。在這項研究中，研究團隊篩選了162個天然噬菌體，他們發現，其中8種噬菌體在靶向大腸桿菌方面表現突出。然后，他們通過CRISPR基因編輯對這些噬菌體進行改造，進而設計出了4種CRISPR-Cas武裝的噬菌體，它們具有更強的靶向并清除大腸桿菌的能力。

　　該研究開發了第一種基于CRISPR-Cas的口服候選藥物，該藥物能夠選擇性靶向并清除大腸桿菌，而不影響其他腸道微生物群。目前該藥物已在進行1期臨床試驗，旨在減少和預防血液類癌癥患者腸道中大腸桿菌易位到血液而導致的致命感染。

　　3、利用AI技術開發新型堿基編輯工具

　　2023年6月27日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組在 Cell 期刊發表了題為：Discovery of deaminase functions by structure-based protein clustering 的研究論文。

　　該研究創新性地運用AI輔助的大規模蛋白結構預測，建立起全新的基于三級結構的高通量蛋白聚類方法，實現了脫氨酶功能結構的深入挖掘，鑒定到完全區別于已知脫氨工具酶的全新底盤元件，包括45個單鏈胞嘧啶脫氨酶（Sdd）和13個雙鏈胞嘧啶脫氨酶（Ddd），研究團隊基于這些脫氨酶開發了一系列新型堿基編輯系統，并在動、植物細胞中進行了測試。還進一步通過蛋白理性設計和功能驗證，開發了新的可被單個腺相關病毒（AAV）遞送的Sdd6-CBE堿基編輯器，在小鼠細胞系中的邊際效率高達43.1%，以及Sdd7-CBE堿基編輯器，在大豆中的編輯效率高達22.1%。

　　該研究成功開發了一系列具有我國自主知識產權的新型堿基編輯工具，突破了現有脫氨酶的應用瓶頸，展現出新型堿基編輯系統在醫學和農業方面廣泛的應用前景。

　　4、首次在真核生物中發現CRISPR樣系統

　　2023年6月28日，張鋒團隊在 Nature 期刊發表了題為：Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease 的研究論文。

　　研究團隊在真核生物中發現了第一個RNA引導的DNA核酸酶——Fanzor，更重要的是，這種新型CRISPR樣系統，可以在重編程后實現對人類基因組的編輯。

　　此外，相比CRISPR-Cas系統，Fanzor系統非常緊湊，更容易遞送到細胞和組織中。而且，Fanzor系統沒有旁系切割活性，可實現更精準的基因組編輯。這項最新研究也提示我們，RNA引導的DNA切割機制存在于所有生物界。

　　值得一提的是，2023年6月14日，張鋒實驗室曾經的研究生、麻省理工學院 Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 團隊（博士生姜凱議為第一作者）在預印本平臺 bioRxiv 上線了一篇題為：Programmable RNA-guided DNA endonucleases are widespread in eukaryotes and their viruses 的研究論文。2023年9月27日，該論文經同行評議后在 Science Advances 期刊發表。

　　該研究表明，Fanzor作為一種可編程的RNA引導的DNA核酸酶廣泛存在于真核生物（Fanzor1）及其相關病毒（Fanzor2）中。Fanzor具有強的核定位信號（NLS），能夠進入真核細胞的細胞核，并在fRNA引導下編輯人類細胞的內源基因，而且沒有旁系切割活性，突出了這些廣泛存在的真核生物RNA引導的核酸酶的應用潛力。

　　5、用CRISPR消除癌細胞中多余的染色體，能夠防止腫瘤生長

　　2023年7月6日，耶魯大學的 Jason Sheltzer 團隊在 Science 期刊發表了題為：Oncogene-like addiction to aneuploidy in human cancers 的研究論文。

　　眾所周知，我們人類的細胞通常有23對染色體，但細胞也可能會多出來額外的染色體，也就是所謂的非整倍性（aneuploidy）。如果我們觀察正常組織，其中99.9%的細胞都有著正常數量的染色體，然而，100多年前，科學家們就發現了幾乎所有的癌癥都是非整倍性，但卻一直不清楚這一現象在癌癥中究竟扮演了什么角色，人們一直在爭論，到底是非整倍性導致了癌癥，還是癌癥帶來了非整倍性。

　　這項研究使用CRISPR-Cas9基因編輯技術來消除癌細胞中的整個染色體，這是一項重要的技術進步，以這種方式操控非整倍性染色體將使我們更好地了解它們的功能。研究結果顯示，攜帶額外染色體的癌細胞依賴這些染色體生長，而使用CRISPR-Cas9消除這些額外的染色體能夠防止腫瘤形成。這一發現也提示了我們，選擇性靶向額外染色體可能為癌癥治療提供新的途徑。

　　6、CRISPR分子剪刀的進化起源

　　2023年9月27日，哥倫比亞大學 Samuel Sternberg 團隊在 Nature 期刊發表了題為：Transposon-encoded nucleases use guide RNAs to promote their selfish spread 的研究論文。

　　該研究把我們的目光帶回過去，通過回看CRISPR-Cas9的前身——跳躍基因（轉座子），揭示CRISPR系統中的“DNA剪刀”是如何進化而來的。該研究證實了RNA引導的DNA核酸酶TnpB和IscB，在防止轉座酶TnpA在轉座過程中的永久性丟失至關重要。

　　這些發現揭示了RNA引導的DNA切割作為一種原始的生化活動出現，以促進轉座子的自私遺傳和傳播，這后來在CRISPR-Cas適應性免疫的進化過程中被用于抗病毒防御。

　　7、減輕臨床上CRISPR-Cas9導致T細胞染色體丟失的策略

　　2023年10月3日，諾貝爾化學獎得主、加州大學伯克利分校的 Jennifer Doudna 教授，聯合加州大學舊金山分校的 Chun Jimmie Ye、斯坦福大學的張元豪、賓夕法尼亞大學的 Carl June 等人，在 Cell 期刊發表了題為：Mitigation of chromosome loss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells 的研究論文。

　　該研究表明，CRISPR-Cas9基因編輯誘導的染色體缺失是一種普遍現象，由此產生的缺陷型T細胞在適應性和增殖上具有劣勢，但仍可以在體外培養中持續存在數周，這可能對臨床應用產生不良干擾。此外，研究團隊提出了一種新的T細胞基因編輯方案，可以減少基因編輯中染色體缺失的發生，提高臨床安全性。

　　8、基因編輯豬器官異種移植新紀錄

　　2023年10月11日，eGenesis 公司的研究人員在 Nature 上發表了題為：Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation 的研究論文。

　　該研究報道了將基因工程豬腎臟移植到非人靈長類動物（NHP）體內的手術設計和成功過程。研究團隊對豬進行了多達69處基因編輯，包括敲除與超急性排異反應有關的聚糖抗原的合成有關的3個基因，敲入了參與調控排異反應反應的多個通路（炎癥、先天免疫、凝血和補體）的7個人類基因，還敲除了豬基因組中的存在的內源性逆轉錄病毒。

　　結合免疫移植療法，這種基因工程豬腎臟在移植后讓食蟹猴存活了超過兩年時間（758天），該研究顯示了豬器官用于人類異種移植的前景，或進一步推動基因修飾的豬器官用于人類臨床試驗。

　　9、病毒對抗細菌CRISPR-Cas免疫系統的新方法

　　2023年10月18日，丹麥哥本哈根大學和新西蘭奧塔哥大學的研究人員在國際頂尖學術期刊 Nature 上發表了題為：Bacteriophages suppress CRISPR–Cas immunity using RNA-based anti-CRISPRs 的研究論文。

　　該研究揭示了病毒（噬菌體）抑制細菌的CRISPR-Cas免疫系統的全新方法——基于小非編碼RNA的抗CRISPR（small non-coding RNA anti-CRISPR，簡稱Racr），這也是基于RNA的抗CRISPR的第一個證據。

　　研究團隊表示，這一發現告訴我們，自然環境中的的微生物動力學，可用于提升基因編輯的安全性，并有望帶來更有效的抗生素替代品。這一發現對科學界來說是令人興奮的，它讓我們對如何阻止細菌的CRISPR-Cas防御系統有了更深入的了解。

　　10、用大數據算法，一次性發現188種新型CRISPR系統

　　2023年11月23日，張鋒團隊在 Science 發表了題為：Uncovering the functional diversity of rare CRISPR-Cas systems with deep terascale clustering 的研究論文。

　　該研究開發了一種新的搜索算法——基于快速局部敏感哈希聚類算法（FLSHclust），使用該算法對三個主要的公共數據庫進行挖掘，這些數據庫包含各種不同尋常的細菌的數據，從中識別出了188種新型CRISPR系統，并對其中4個系統進行了詳細表征，這些新系統可能被用來編輯哺乳動物細胞，其脫靶效應比目前的CRISPR-Cas9系統要少，也有可能在被用于診斷或用來記錄細胞內部活動。

　　這項研究凸顯了CRISPR前所未有的多樣性和靈活性，也表明了大多數CRISPR系統是罕見的，只在不尋常的細菌和古細菌中發現。隨著可用來搜索數據庫的不斷增長，可能還有更多罕見系統被發現。