2.3.3小規模快速制備果蠅RNA

Northern 樣品緩沖液lmol L 乙酸酚氯仿DEPC 處理的水GHCL 溶液無水乙醇

一 材料與設備

1)Northern 樣品緩沖液：2.2mol/L 甲醛，1mol/LMOPS，50% 甲酰胺

2)lmol/L 乙酸

3) 酚：氯仿（1:1)

4)DEPC 處理的水

5)GHCL 溶液：5mol/LDTT，7.5mol/L 鹽酸胍，25 mmol/L 乙酸鈉 (pH7.0)
0.5%N-月桂肌氨酸

6) 無水乙醇


二 操作方法

1) 把果蠅或果蠅胚胎放入裝有 GHCL 溶液的 1.5 ml 離心管屮每只果蠅或 50?100 個果蠅胚胎需 50ulGHCL 溶液，最多處理 20 只果蠅

2) 用小研杵快速勻漿樣品

3) 勻漿液中加入等體積的酚：氯仿，振搖混合
.
4) 在微量離心機中以最大轉速離心 2 min

5) 上層水相轉移到一個新的小離心管中

6) 每 50ulGHCL 溶液加入 lmol/L 的乙酸和 25ul 無水乙醇，以沉淀 RNA

7) 于-20℃ 放置 3?24 h。

8) 在微最離心機中以最大轉速離心 5 min

9）小心去掉上清，再以最初所用的一半體積的 GHCL 溶液溶解沉淀最小體積為 (50ul),

10) 按第至第 9) 步的方法重新沉淀 RNA。

11) 若有必要，再按上述方法沉淀 RNA—次。

12) 在 RNA 沉淀中加入第一步所用的 GHCL 溶液體積的無水乙醇，混合。

13) 用微量離心機以最大轉速離心 15mim。

14) 去掉乙醇，如有必要再用無水乙醇再洗一遍。

15)RNA 沉淀可在合適的緩沖液或無水乙醇屮保存。如果 RNA 用來作 Northern 印跡分析，最好用 Northern 樣品緩沖液溶解。

1) 如果需要非常純凈的 RNA，按第 6) 至第 9) 步的方法共沉淀 RNA 三次

2) 為了最大限度的降低 RNA 酶的作用，操作時要戴手套，并經常更換，所有溶液都需用 DEPC 處理過的水配制。