ACSChem.Biol│基于分子邏輯門細胞內脂質單分子成像追蹤

　　今天為大家介紹一篇ACS Chem. Biol.的文章 “A Molecular Logic Gate Enables Single-Molecule Imaging and Tracking of Lipids in Intracellular Domains”，文章的通訊作者是來自瑞士洛桑聯邦理工學院的助理教授Pablo Rivera-Fuentes。在這篇文章中，作者發展了一種熒光分子邏輯門，該熒光分子邏輯門需要光，親脂環境和親核試劑三者的連續輸入，產生熒光信號。作者利用這一方法實現了對細胞內脂滴邊界的高分辨、選擇性成像，并對脂滴和內質網間運輸的單分子脂質進行了追蹤。

　　脂滴是一種廣泛存在于細胞中的亞細胞結構，其主要成分包括磷脂單分子層和內含的中性脂，這一結構的功能主要包括儲存能量、脂肪吞噬以及參與細胞內多種信號通路轉導，因而通過成像的手段追蹤細胞內脂滴的運動軌跡對深入研究其生理功能有著十分重要的意義。在已有研究中，熒光蛋白、抗體及小分子染料已被用于脂滴的標記成像，但受到傳統光學顯微鏡分辨率的限制，這些方法均不適用于對細胞內脂滴的進行單分子標記成像。

圖1. 熒光分子邏輯門用于選擇性標記脂滴。

　　在本文中，作者發展了一種熒光分子邏輯門，其可對細胞內的脂質進行單分子成像。光誘導的重氮酮類物質發生沃爾夫重排反應時，產物的結構會因反應條件的不同而發生變化(如圖1A)。作者發現，在非極性的溶劑中，光激活重氮酮類物質易形成烯酮中間體，當存在親核試劑時，可加成得到熒光物質。而在非極性的溶劑中，光激活重氮酮類物質，產物不能產生熒光信號。兩種不同的途徑間的選擇性是通過溶劑穩定兩種不同反應中間體來控制的。基于此，作者發展了一種對脂質分子選擇性成像的熒光分子邏輯門(如圖1B)：即當光，親脂環境和親核試劑三者的連續輸入，可特異性標記脂分子，產生熒光信號。

圖2. 微流控液滴用于表征熒光探針對脂滴的選擇性標記。

　　作者首先在微流體芯片產生的液滴中，考察了該探針對脂滴標記的選擇性。作者利用BODIPY 493/503對微流控芯片中的脂滴進行定位。在脂滴的非極性環境內，光激活生成烯酮中間體。烯酮中間體通過自由擴散進入水相，隨后水作為親核試劑進攻烯酮中間體并生成熒光產物，因而僅在水相中觀察到熒光信號(如圖2.DE)。

　　為了特異性標記脂滴的邊界，作者在化合物1(如圖2A)的基礎上增加了棕櫚酸化修飾，得到了化合物6(如圖2F)，其飽和碳鏈可將極性熒光產物固定在油滴上，同時帶負電荷的羧酸鹽官能團將染料定位在油水兩相交界處，易于與親核試劑H2O反應。實驗結果表明：熒光信號在液滴的邊界處顯著增加，但在核心或水相中并未增加。

圖3. 分子邏輯門在活細胞水平上選擇性標記脂滴。

　　作者接著在活細胞水平上，表征熒光探針對脂滴選擇性標記的能力。作者在HeLa細胞中誘導脂滴形成。用405 nm激光照射細胞以激活探針。熒光探針與染料BODIPY 493/503的熒光信號在細胞中存在共定位。進一步對熒光信號觀察可發現，BODIPY 493/503熒光信號聚集在脂滴核心位置，而熒光探針的熒光信號顯著富集在脂滴外圍(如圖3C-D)。以上結果表明，熒光探針能夠在活細胞水平中能夠選擇性地標記脂滴的邊界。

圖4. 3D-SMLM表征熒光探針對脂滴的選擇性標記。

　　最后，作者利用單分子定位顯微技術，對細胞內的脂滴進行單分子成像。相比于傳統顯微鏡，單分子定位顯微鏡具有極高的分辨率，脂滴的形態可被清晰呈現(如圖4B-E)。3D-SMLM重建圖片顯示，熒光信號呈殼狀，并具有深色核心，表明熒光探針主要標記了脂滴的邊界(如圖4F-I)。作者使用該探針，在活細胞水平上對追蹤脂分子的移動。他們發現：在脂滴內部，脂分子存在快速移動和擴散。同時在脂滴和內質網之間也存在脂分子的交換。

　　總之，作者發展了一種熒光分子邏輯門，該熒光分子邏輯門需要有光，親脂環境和親核試劑三者的組合輸入，可實現對于細胞內脂滴邊界進行選擇性成像。他們對其結構進行修飾，將此分子邏輯門應用到了微流控油滴模型和活細胞中，可實現脂質液滴外圍的持續標記。同時，由于該探針具有出色的光物理性質，使其適用于細胞中的3D-SMLM成像以及2D單分子跟蹤，并揭示了細胞內脂滴與內質網之間脂分子交換。作者認為，用于成像的分子邏輯門的概念可以擴展到其他非極性體系中，例如液液相分離形成的無膜細胞器中的單個脂分子移動軌跡。