1.Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或無特異性蛋白帶）
2.Problem：信號弱（1-30秒的曝光后檢測不到信號）
3.Problem：無著色
4.Problem：著色太淺
5.Problem：著色太深
6.Problem：不正確的染色
Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或無特異性蛋白帶）
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Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或無特異性蛋白帶） Cause：一抗的稀釋沒有使用正確的緩沖液和正確的濃度 Solution： 使用推薦的阻斷劑和TBS/T稀釋抗體并4℃孵育過夜。多克隆抗體使用5%的BSA；單克隆抗體使用5％的脫脂奶粉 Cause：化學 發光檢測時沒有使用相應的膜 Solution：使用高質量的nitrocellulose或 PVDF膜 Cause：膜阻斷不足導致一抗或二抗產生大量的非特異性結合 Solution：用含5％脫脂奶粉的TBS/T在室溫阻斷1小時（不能超過一個小時） Cause：二抗的稀釋沒有使用正確的緩沖液和正確的濃度，或二抗的特異性差 Solution：一些二抗會與蛋白產生非特異性的結合。因此在檢測中可加入一步二抗的對照試驗，在沒有一抗的情況下，直接加入二抗孵育。也可將二抗用含5％脫脂奶粉的TBS/T在室溫下孵育1小時 Cause：配制試劑的用水水質不佳 Solution：在配制試劑時（尤其是 磷酸化抗體）使用Milli-Q或其它超純的去離子水 |
Problem：不正確的染色
| Cause：底物反應時間太長 | Solution：減少底物反應時間 |
| Cause：一抗或二抗的濃度太高 | Solution：降低一抗或二抗的濃度2-3倍 |
| Cause：阻斷不足 | Solution：延長阻斷時間或提高 血清濃度 |
| Cause：切片的質量不好 | Solution：選用質量好的組織切片 |
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Problem：信號弱（1-30秒的曝光后檢測不到信號） |
| Cause：一抗孵育不足 Solution：適當延長孵育時間（4℃孵育過夜） Cause：轉膜不完全 Solution：轉膜時采用更高的電壓和更長的時間。也可采用預染的蛋白Marker 監控轉膜的過程 Cause：阻斷膜超時 Solution：阻斷膜的時間不能超過1小時 Cause：蛋白的表達水平低于檢測底限 Solution：在每孔中加入更多的蛋白；先采用免疫沉淀法富集蛋白；換用表達高的樣本或細胞；檢測前適當刺激蛋白的表達 Cause：二抗與一抗的結合率太低 Solution：提高二抗的濃度或換用與一抗匹配的二抗 Cause：配制試劑時發生交叉污染 Solution：重新配制各種試劑 |
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CST 免疫組化 疑難解答 |
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Problem：無著色 Cause：組織切片的質量不好或固定不足 Solution：更換好的組織切片 Cause：底物反應時間太短 Solution：延長底物反應時間，直至出現著色 Cause：不合適的一抗或二抗 Solution：更換一抗或二抗 Cause：沒有執行抗原修復 Solution：執行抗原修復 Cause：試劑的配制不正確 Solution：重新配制試劑 Cause：蛋白表達太低 Solution：加入對照試驗 |
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Problem：著色太淺 應時間太短 Solution：延Cause：底物反長底物反應時間 Cause：一抗的濃度太低或孵育不足 Solution：提高一抗的濃度（1:50;1:100） Cause：蛋白表達太低 Solution：加入對照試驗 |
| Problem：著色太深 Cause：底物反應時間太長 Solution：減少底物反應時間 Cause：一抗或二抗的濃度太高 Solution：降低一抗或二抗的濃度2-3倍 Cause：切片的質量不好 Solution：選用質量好的組織切片 Cause：組織切片沒有進行阻斷 Solution：用含5％ 血清的阻斷液阻斷1小時 Cause：沖洗不完全 Solution：每次沖洗時間不低于5分鐘 Cause：二抗與樣本發生交叉反應 Solution：選用合適的二抗 |