CST抗體WesternBlot常見問題與解答

CST抗體－Western－Blot常見問題與解答

1.Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或無特異性蛋白帶） 2.Problem：信號弱（1-30秒的曝光后檢測不到信號） 3.Problem：無著色 4.Problem：著色太淺 5.Problem：著色太深 6.

western－blot常見問題及解答

　　常見問題及解答：　　1 、兩快玻璃板之間灌膠 , 膠為什么總是不平 ?　　1)你的玻璃洗干凈沒有？應該要洗得非常干凈！　　2)過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對較多，凝膠凝固過快也會膠不平，最多按照分子克隆加倍　　3)加完試劑以后沒有很好的搖勻，導致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快

定量western－blot疑問解答：為什么需要驗證抗體？

驗證抗體對于結果的一致性和重復性是至關重要的，即確認抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應性情況。在您的論文提交給期刊發表之前，經常需要驗證抗體的特異性，但并非所有人都花時間進行驗證。或者很多人都認為他們使用抗體進行了免疫共沉淀驗證，因而不需要再通過蛋白質印跡進行驗證。然而，抗體與抗

定量western－blot疑問解答—為什么需要驗證抗體？

驗證抗體對于結果的一致性和重復性是至關重要的，即確認抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應性情況。在您的論文提交給期刊發表之前，經常需要驗證抗體的特異性，但并非所有人都花時間進行驗證。或者很多人都認為他們使用抗體進行了免疫共沉淀驗證，因而不需要再通過蛋白質印跡進行驗證。然而，抗體與抗

Western－Blot實驗技術詳解和常見問題解答

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被

Western－Blot常見問題總結

　　Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與或標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電

eBioscience流式抗體常見問題與解答

1、eBioscience公司提供了哪些抗體？ ?A：物種——人、小鼠、大鼠、非人靈長類、犬類等。檢測指標——包括細胞表面標記（CD分子，膜骨架，趨化因子受體）和胞內指標（細胞因子，核內轉錄因子）。抗體標記——生物素標記抗體，親和純化抗體以及直標熒光素抗體。eB抗體的直標熒光素有（括號內是發射光波長

Western－Blot中抗體的選擇

Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等

Western－blot常見問題及其解決方案

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)2

四、主要步驟 生物秀為您搜集了現階段幾乎網上所有的Western Blot的中英文資料，僅供實驗參考，可以根據自己實驗的實際情況進行調整： Western Blot PROTOCOL： 點擊查看所有相關文章 五、 實驗常見的問題指南 根據問題的類型主要分成以下幾類（以

Western－Blot詳解－常見的問題指南（一）

?實驗常見的問題指南根據問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權作參考，請勿盲目模仿！）：1.?參考書推薦A.?對初學者看什么資料比較好？解答：《抗體技術實驗指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）兩本書不錯

免疫共沉淀與Western－Blot

免疫共沉淀與Western Blot實驗步驟:1．以60mm 細胞培養皿為例，細胞轉染后24－36 小時后，吸凈培養液（可用PBS小心漂洗一次）。2．加入500μl 預冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解細胞5 分鐘。3．將細胞裂解液轉移到1.5 ml eppondorf 管內，

抗體常見問題解答

　　常見問題： 　　如何選擇合適的一抗？ 　　如何選擇合適的二抗？ 　　如何選擇合適的同型對照？ 　　如何選擇陽性對照？ 　　如何確定一抗的稀釋比例？ 　　如何選擇合適的抗原修復方式？ 　　為何WB檢測條帶大小與預期有差別？ 　　抗體能夠用于其他種屬/實驗方法？ 　

抗體常見問題解答

　　Q&A 　　常見問題： 　　如何選擇合適的一抗？ 　　如何選擇合適的二抗？ 　　如何選擇合適的同型對照？ 　　如何選擇陽性對照？ 　　如何確定一抗的稀釋比例？ 　　如何選擇合適的抗原修復方式？ 　　為何WB檢測條帶大小與預期有差別？ 　　抗體能夠用于其他種屬/實驗

關于抗體的選擇

對于國內的大多數實驗室來講，做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，買進口抗體捉襟見肘，買國產抗體得需要大無畏的勇氣。在我們實驗室western blot實驗歷程里，我們用過進口抗體，進口抗體國內分裝包裝，國產抗體，質量良莠不齊。 進口抗體一般不會出現閃失：Abca

western－blot技術要點和WB常見問題分析

WB過程中常見的問題及可能原因分析

免疫印跡（Western－Blot）常見問題及建議

? ? ? ? ? 問題? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 可能原因? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 建議電泳條帶成笑臉狀膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統溫度偏高減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳電泳條帶成皺眉狀可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃

Western－Blot詳解（二）

11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標記的第二

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)8

EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。 解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)4

HH. 跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？ 解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸發，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)6

YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。ZZ. “轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-Bu

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)1

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術:一、原理二、 分類i.放射自顯影ii.底物化

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)5

NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V4

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)3

P. 有什么方法可以提高上樣量？ 解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。 Q. 我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機，有沒有直接用低溫高速離心機就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？ 解答：如是需要提取膜蛋白

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)11

11. 結果分析 CCCC. 條帶有時清晰，有時很散，不知為何？ 解答：可能原因：樣品可能存在降解；轉膜不及時造成擴散；轉移緩沖液甲醇濃度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）。 DDDD. 顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)10

UUU. 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會跑的好些?還有前面有人說電泳液平玻璃板會使電泳條帶漂亮些? 解答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)9

MMM. 磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？ 解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。我做的時候從未加過，都做出來了。 NNN. Western Blot中block的最短時間? 解答：每一步1小時足夠了， 中間換抗體

Western－Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)7

CCC. Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次發光protocol:1.stripping buffe

western－blot原理

Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢

Western－Blot－Protocol

一、提取抗原蛋白將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min,?吸取上清至新管中,?加入750μl異丙醇,?混勻,?靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min,?棄上清,?加入1ml 0.3mol/L