DNA酶切及凝膠電泳（gelelectrophoresis）

材料、設備及試劑
　　一、 材料
　　λDNA: 購買或自行提取純化; 重組T-vector質料或pUC19質粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產的電泳用瓊脂糖均可。
　　二、 設備
　　水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機及其附件。
　　三、 試劑
　　1、 5×TAE電泳緩沖液：
　　2、 6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
　　3、 溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于 室溫即可。
操作步驟
　　一、 DNA酶切反應
　　1、 將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
　　2、 混勻反應體系后,將eppendorf管置于適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應完全。

　　3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存備用。
　　二、 瓊脂糖凝膠的制備
　　1、 取5×TAE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
　　2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
　　3、 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持 1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TAE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
　　4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip 頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
　　5、 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
　　6、 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
　　7、 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。 經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據熒光條帶的深淺選擇)。
　　8、 DNA分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
　　9、 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪制標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
　　10、 DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。