ELISA原理與分類介紹（三）

ELISA中的試劑－免疫吸附劑

臨床檢驗中一般采用商品盒進行測定。ELISA中有三個必要的：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。

完整的ELISA盒包含以下各組分：

（1）已包被抗原或的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標記的抗原或（結合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；

（5）結合物及標本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應終止液。

3.1　免疫吸附劑

已包被抗原或的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。

3.1.1　固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯孔條或12聯孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數之差，應小于10%。

與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。

在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可根據需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。

也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，盒一般均配以特殊儀器。

3.1.2 　包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體結合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。

脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA一般采用這種包被方式。