實驗概要
1. 通過實驗了解熒光原位雜交技術的基本原理和實驗技術
2. 掌握原位雜交技術的操作方法及熒光顯微鏡的使用方法
3. 了解其在生物學、醫學領域的應用
實驗原理
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代初期在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、雜交特性高、檢測信號強和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。
雜交所用的探針大致可以分為三類：1）染色體特異重復序列探針，例如a衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，易于檢測；2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素對探針進行標記，雜交之后用耦聯熒光素的抗生物素的抗體進行檢測，同時還可以利用幾輪抗生物素蛋白—熒光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—熒光素的處理，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是用熒光素直接標記探針。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由于不能將信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。
主要試劑
簇毛麥DNA探針
小麥基因組DNA
鮭魚精DNA（Salmon sperm DNA, 10mg/ml）
去離子甲酰胺
20×SSC
50%硫酸葡聚糖
PI（碘化丙啶）溶液
FITC-conjugated avidin
BSA
無水乙醇
主要設備
恒溫水浴鍋
培養箱
染色缸
載玻片
熒光顯微鏡
蓋玻片
封口膜
200mL移液器
20mL移液器
實驗材料
簇毛麥－小麥易位系（6VS/6AL）中期染色體標本
實驗步驟
1. 染色體制片：經-70°C冰凍后揭去蓋玻片，在100%酒清中脫水過夜，氣干。
2. 配雜交液：按每張18mm×18mm制片10μl體積配制雜交液，依次向1.5ml Ependorf管中加入：
| 藥品 | 用量（6張制片） | 終濃度 |
| 鮭魚精DNA（Salmon sperm DNA, 10mg/ml） | 18μl | 3μg/μl |
| 封阻DNA（小麥基因組DNA，1.2μg/μl） | 14μl | 0.3μg/μl |
| 在旋渦上混勻，抽干后（約30分鐘）繼續加入： | ||
| 簇毛麥DNA探針 | 12μl | 0.002μg |
| 去離子甲酰胺（Deonized Formamide） | 30μl | 50% |
| 20×SSC（3M NaCl, 0.3M醋酸鈉） | 6μl | 2×SSC |
| 50%硫酸葡聚糖（dextran sulfate） | 12μl | 10% |
總體積 60μl
雜交液配好后在旋渦器上充分混勻。
3. 雜交液變性：雜交液用封口膜封上，在沸水浴中變性10分鐘，立即置冰上，冰浴至少5分鐘。
4. 染色體變性：制片在70%甲酰胺中（35ml甲酰胺，5ml 20×SSC，10ml ddH2O）78°C下處理1’10”，取出后立即在-20°C的70%、95%、100%乙醇中脫水各5分鐘，氣干。
5. 雜交：每張制片加10μl經變性處理的雜交液，蓋上18mm×18mm蓋片，放在保持濕潤的保鮮盒中，置37°C雜交箱中雜交6小時以上（通常過夜）。
6. 洗脫：取出經過雜交的制片依次在2×SSC（室溫，5分鐘）、2×SSC（42°C，10分鐘）、2×SSC（室溫，5分鐘）和1×PBS（室溫，5分鐘）溶液中洗脫未雜交的探針。
7. 配檢測液及檢測：
（1）使用前，按每張制片70μl配檢測液，依次向1.5ml Ependorf管中加入：
藥品 | 用量（6張制片） |
BSA（10mg/ml） | 180μl |
ddH2O | 186μl |
10×PBS | 42μl |
FITC-conjugated avidin (Enzo diagnostic, 500μg/ml) | 12μl |
總體積 420μl （2）混勻后，每張制片加70μl，蓋20mm×20mm蓋玻片，37°C，30min以上，保持黑暗。 （3）移去蓋玻片，在黑暗下依次用1×PBS（室溫，5分鐘）、1×PBS（室溫，5分鐘）、1×PBS（室溫，5分鐘）沖洗，然后仍在黑暗下依次經過70%、95%、100%乙醇脫水各5min，氣干。 （4）套染、封片：每張制片加12μl PI稀釋液，蓋上22mm×22mm蓋片封片（保持黑暗）。
8. 觀察和照相：先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490nm。簇毛麥雜交信號呈黃綠色，小麥染色體被PI染成紅色。照相記錄實驗結果。
注意事項
附1 FISH相關部分溶液的配制 1. 20×SSC：175.3g NaCl, 882.g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調pH至7.0） 2. 10X PBS:76g NaCl,18.8g Na2HPO4×7H20,4.1g NaH2PO4×H20,加水至1000mL（調pH 至7.0） 3. PI溶液配制：400μl Vectashield TM Mounting medium for fluorescence 10μl PI母液
附2 探針的生物素標記 探針的標記可采用隨即引物擴增法、%E
新冠病毒的主力檢驗儀器和試劑是PCR和相關試劑盒，推薦輔助設備基因測序儀和相關試劑盒，PCR、測序儀、相關試劑均屬于分子診斷。新冠肺炎的全球蔓延，將近年來火熱的分子診斷技術再推......
2018年6月15日，北京——安捷倫科技公司（紐約證交所：A）日前宣布推出新的配套試劑盒，使DakoOmnis系統可以同時使用三種不同的技術對組織樣品進行分析。系統配備這一新款試劑盒后，不僅可以執行免......
快速、簡單、準確的安捷倫魚類DNA檢測技術成為海產品種類鑒定和標簽信息驗證的常規檢測方法2010年3月8日，佛羅里達州奧蘭多市，匹茲堡儀器博覽會(Pittcon)2010—安捷倫科技公司(紐約證交所代......