HPLC法測定谷物中黃曲霉毒素含量

方案優勢

定量準確，精密度高而且操作極為方便。

采用標準

國家相關標準

方法/原理/步驟

　　標準品的準備

　　標準品包括了黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2各單一標準液和混合標準液，溶劑為乙腈，黃曲霉素混合標準液的濃度為2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。單一標準液用來確定各自的保留時間，具體工作用混合標準液是將所提供標準液稀釋10倍，用微量注射器分別取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀釋標準液(具體濃度為200ng/ml的B1、G1；50ng/ml的B2、G2)，和樣品一樣蒸干，用三氟乙酸衍生，定容于0.2ml流動相，故所得進針的濃度分別是：B1、G1為5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml；G2、B2為1.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。

　　樣品

　　實驗所用樣品包括玉米、小麥等，取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g。因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大(有地方建議取15kg)。

　　樣品的提取和凈化

　　使用粉碎機將樣品研細，稱取25g研細樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水(體積比84：16)溶液。在旋轉震蕩器上震蕩1h。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中。轉移8ml樣品提取液通過PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱，推出大約4ml的凈化液(具體過程見圖1)，轉移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶。在水浴60℃條件下用氮氣吹干。

　　標準曲線及回歸方程

　　按實驗方法進行測定，4種黃曲霉毒素的標準曲線、回歸方程及檢出限(按3倍信噪比計算)的測定結果。

　　樣品的加標回收實驗

　　取玉米樣品一份，分別做兩個濃度的加標回收實驗。具體做法是：取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl和25μl黃曲霉素混合標準液(1 000ng/ml黃曲霉素B1、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2、G2)作為加標。經過和樣品一樣的處理,得出其最后的理論濃度見下式。

　　①B1、G1濃度：(0.010ml×1 000ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=12.5ng/ml；

　　(0.025ml×1 000ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=31.25ng/ml。

　　②B2、G2濃渡：

　　(0.010ml×250ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=3.125ng/ml；

　　(0.025ml×250ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=7.812 5ng/ml。

　　精密度實驗

　　按實驗方法進行樣品處理，對同一樣品連續測定5次。

儀器設備

　　試劑和儀器

　　乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、疊氮化鈉(分析純)、去離子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱、高效液相色譜儀、2475熒光檢測器。

　　柱前衍生及液相色譜條件

　　向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸，立即旋緊蓋子。渦旋30s，在40℃烘箱中衍生15min，室溫下氮氣吹干混合物，用200μl水-乙腈(體積比85：15)溶解殘余物并渦旋30s，將其轉移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min，把已經制備凈化好的150μl樣品液轉移到HPLC樣品瓶，進樣25μl。

結果和結論

　　結果

　　4種黃曲霉毒素的分離情況

　　取50μl黃曲霉毒素混標工作溶液(濃度為B1、G1 200ng/ml；G2、B2 50ng/ml)于棕色瓶內，吹干，衍生，流動相定容，經液相色譜分離得出的標準色譜分離見圖2。黃曲霉毒素G1、B1的濃度為50ng/mlG2、B2的濃度為12.5ng/ml。

　　結論　

　　從市面上抽取10份玉米樣品,按此實驗方法進行處理，結果為未檢出黃曲霉毒素。此方法簡便易行、快速準確、靈敏度高、檢測限低，適合大批量檢測，值得推廣