LCMS／MS對獸藥多殘留檢測的提取和凈化

應用優勢

?高效、省時的多級/多殘留方法。

? 直接制備大量組分樣本。

?快速、靈敏UPLC?/MS分析

沃特世解決方案

ACQUITY UPLC?, Xevo? TQ MS, Sep-Pak? C18柱

關鍵詞

UPLC-MS/MS、Sep-Pak固相萃取柱、獸藥、豬肉、雞肉、魚

概述

為了確保公共健康安全，需要對肉類和其他可食用組織樣本中獸藥殘留含量進行可靠地篩選分析，相應化合物包括強極性水溶性化合物至非極性脂溶性化合物，每種化合物或每類化合物都有非常有效的提取和凈化程序，但這些方法并不非常適合于多級、多殘留物的篩查分析。

? 溶劑提取(用過量乙腈或甲醇)對于牛奶中的許多獸藥殘留物可很有效，但該方法并不太適用于如沙丁胺醇等高水溶性的藥物。

?緩沖溶液提取也能適用于許多化合物，但如地塞米松等脂溶性化合物并不太適用于該方法。

?傳統固相萃取(SPE)濃縮和凈化(富集/淋洗/洗脫)在多殘留物分析中的應用有限，因為不同化合物的酸性/極性/溶解度范圍非常寬，分散型或透過型SPE更適用于多殘留物方法。

引言

為串聯LC/MS檢測組織樣本中的大量不同獸藥殘留物開發了優化樣品制備和分析方案。選擇了三種類型的肌肉組織樣本(豬肉、雞肉和鮭魚肉)介紹該方法的適應性，用酸化乙腈/水溶劑處理樣品和沉淀蛋白質，提取獸藥成分。然后使用Sep-Pak C18固相萃取柱或96孔萃取板進行簡單SPE凈化，經過蒸發和復溶后，使用串聯LC/MS分析樣品，從主要獸藥中選擇有代表性的化合物，包括四環素、氟喹諾酮、磺胺類藥物、大環內酯類、β-內酰胺、非甾體類抗炎藥、類固醇和β-腎上腺素。

實驗

LC條件

系統： ACQUITY UPLC 系統

色譜柱： ACQUITY UPLC CSH? C18, 1.7μm,

100 mm x 2.1 mm內徑

流動相： A：0.1%甲酸的水溶液

B：0.1%甲酸乙腈溶液

進樣量： 7 微升

進樣模式： Partial loop 進樣

柱溫： 30 °C

弱洗脫溶劑： 10:90乙腈:水(600μL)

強洗脫溶劑： 50:30:40

水：乙腈：IPA(200μL)

密封清洗： 10/90 乙腈/水

梯度:

質譜條件

檢測器 Waters Xevo TQ

電離模式： 正離子電噴霧電離

(除氯霉素使用負離子模式外)

離子源溫度： 150°C

脫溶劑氣溫度： 500°C

脫溶劑氣體流速： 1,000 L/hr

錐孔氣體流速： 30 L/hr

碰撞氣體流速： 0.15 mL/min

軟件： MassLynx? v4.1

樣品制備

1. 分離/沉淀

將5克均化組織樣本置于50毫升離心管中，加入10毫升含有0.2%甲酸的80：20乙腈/水溶液中，渦旋震蕩30秒鐘，在振蕩器放置30分鐘，用12000rpm離心5分鐘。萃取/沉淀過程會很好地提取多數化合物組分，但也會提取大量脂肪。

2. SPE凈化

量取1毫升上清夜(從步驟1)，用Sep-Pak C18固相萃取柱或萃取板進行SPE凈化(見圖1的SPE詳細內容)該步驟會清除脂肪和非極性干擾物。

Sep-Pak C18固相萃取柱1cc、100毫克

圖1. SPE凈化方案。

表1總結了該實驗中的MRM離子對和儀器參數。表1中還有每種化合物的典型基質匹配校準數據(使用豬肉基質中的離子對計算)。

表1. 雞肉基質中得到的MRM離子對和校準數據（其他基質類似）。

結果

圖2顯示了10ng/g的紅霉素基質標得到的典型LC/MS色譜圖，其他化合物性質類似。表2顯示了組織樣品加標回收得到的回收率數據表3顯示了觀察到的基質對多殘留物分析的影響。

圖2. 用10ng/g紅霉素加標的豬肉得到的LC-MS/MS提取離子色譜圖。

討論

該研究中使用的方法是Lehotay等人1和Martos等人2提出的方法開發，參考文獻1中使用的方法在組織提取溶劑中未使用酸，在這樣的條件下我們發現四環素的回收率低于5%，氟喹諾酮的回收率高于50%，參考文獻2中使用的方法介紹在離心處理前將萃取物用1%甲酸酸化處理，這樣的條件下青霉素的回收率低于10%，而我們的方法則為48%，我們的萃取程序綜合參考文獻1和參考文獻2所介紹方法，采用了類似的乙腈/水萃取方法，但甲酸濃度為0.2%，實現了更均衡的回收率和最低的不穩定化合物的降解。

另一種方法基于Kauffman等人3提出的方法，其中進行了兩次萃取，第一次是用琥珀酸緩沖液萃取水溶性化合物，第二次用乙腈在萃取過的固體顆粒上再進行一次萃取，該方法要求對樣品進行單獨的提取，然后將提取溶劑混合進行分析，性能僅比之前的方法稍好，但時間和材料成本卻明顯降低，該研究選擇的萃取、凈化和分析方案實現了前處理時間、成本和方法性能之間的良好平衡。

表2. 從三種基質的加標組織樣品中的回收率數據。

表3. 觀察到的三種基質的加標組織樣品的(%離子-抑制)基質影響(負
值為離子增強)。

結論

? 為肉類、雞肉和鮭魚分析開發和演示了一種簡單的萃取/蛋白質沉淀方法。

?該方法適用于篩查大量不同種類的獸藥殘留物。

? 回收率平均為60%，所有組織都類似。

? 使用Sep-Pak C18的穿透式SPE凈化方案可以有效清除殘留脂肪。

?樣品前處理方法可得到無顆粒的萃取物，在LC/MS分析前無需再進行過濾。