| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液和溶劑
乙醇，NaCl（1 mol/L，用 TE ( pH 8.0 )配制），乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2 )，TE ( pH 8.0)。
2. 酶和緩沖液
無 DNase 的胰 RNase
3. 核酸和寡核苷酸
DNA 樣品，CsCl 密度梯度離心純化
4. 離心機和轉子
Beckman SW 50.1 轉子或可適用相應離心管的替代轉子， Sorvsll SS-34 轉子或性能相同的替代轉子
二、方法
1. 測定質粒制備物體積。加入 0.1 倍體積的 3 moI/L 乙酸鈉（pH 5.2 ) 和 2 倍體積的乙醇，混勻后于 4℃ 放置 30 min。
2. 于 4℃ 用大于 10000 g ( 轉速大于 9100 r/min 時用 Sorvall SS-34 轉子）離心 15 min, 回收核酸沉淀，盡可能去掉上清液，然后打開管口，在工作臺上放置幾分鐘，使最后殘留的微量乙醇蒸發殆盡。
3. 用 0.5~1 ml TE ( pH 8.0）溶解潮濕的 DNA 沉淀。
質粒 DNA 濃度應不少于 100 μg/ml。
4. 加無 DNase 的 RNase 至終濃度為 10 μg/ml，室溫溫育 1 h。
5.
準備一個 Beckman SW 50.1 離心管（或相當的離心管）加入 4 ml 含 1 mol/L NaCl 的 TE ( pH
8.0)，用帶有一次性吸頭的自動移液器在 1 mol/L NaCl 溶液上部加鋪一層 1 ml 經 RNA 酶處理過的質粒 DNA
樣品。必要時，可酌情用 TE ( pH 8.0 ) 充滿離心管。
6. 于 20℃ 用大于 150000 g（轉速大于 40000 r/min 時，用 Beckman SW50.1 轉子）離心 6 h, 小心去掉上清液。
質粒 DNA 沉淀在管底，而寡核苷酸和小片段 DNA 留在上清中。
7. 用 0.5 ml TE ( pH 8.0）重新溶解質粒 DNA 沉淀，加 50 μl 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2), 將 DNA 溶液轉移到微量離心管中。
8. 加 2 倍體積的乙醇，于 4℃ 放置 10 min, 沉淀 DNA。然后于 4℃ 以大于 10000 g 離心 15 min, 盡量去盡上清液，打開管口，放置在工作臺上放置幾分鐘，讓最后殘留的痕量乙醇蒸發殆盡。
9. 用 TE ( pH 8.0 ) 溶解潮濕的質粒 DNA 沉淀。
展開 |
