Nature子刊：一種測量能量代謝調節環路的新標記——Brs3

　　來自美國NIH美國國家糖尿病、消化及腎臟疾病研究所（NIDDK）的研究人員發表了題為“Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake”的文章，發現背內側下丘腦（DMHBrs3）中表達Brs3的神經元一旦突然激活就會導致體溫，棕色脂肪組織溫度，能量消耗，心率和血壓的增加，從而指出Brs3表達是一種測量能量代謝調節環路的潛力標記。

　　來自美國NIH美國國家糖尿病、消化及腎臟疾病研究所（NIDDK）的研究人員發表了題為“Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake”的文章，發現背內側下丘腦（DMHBrs3）中表達Brs3的神經元一旦突然激活就會導致體溫，棕色脂肪組織溫度，能量消耗，心率和血壓的增加，從而指出Brs3表達是一種測量能量代謝調節環路的潛力標記。

　　這一研究成果公布在Nature Neuroscience雜志上，由Marc Reitman等人領導完成。

　　BRS3是一種孤兒G蛋白偶聯受體，具有良好的保守性，在特定的大腦區域上大量表達。這種受體所在的G蛋白偶聯受體 A家族包括有神經介素B和胃泌素釋放肽受體。哺乳動物BRS3缺乏已知的內源性高親和力配體，并且對蛙皮素具有低親和力，蛙皮素在哺乳動物中尚未發現。

　　小鼠靶向敲除Brs3會導致肥胖，這其中涉及能量消耗減少，食物攝入量增加，靜息Tb和靜息心率降低等。一般認為，BRS3激動劑能增加靜息Tb，能量消耗，心率和血壓，活性棕色脂肪組織（BAT），減少食物攝入量，目前關于Brs3神經元群體的位置和指導這種生理學的特定環路仍有待探索。

　　BRS3存在于腦核中，大部分位于下丘腦中。表達Brs3與Tb，能量消耗和食物攝入的調節密切相關，因此可以作為治療代謝性疾病重要環路的潛力標記。

　　研究結果

　　1.Brs3表達模式

　　為了研究表達Brs3的細胞的功能，研究人員將他莫昔芬誘導Cre重組酶基因靶標插入天然Brs3基因座中，構建了Brs3-2A-CreERT2（Brs3-Cre）小鼠（圖1）。同時他們也采用了Cre依賴性tdTomato報道系（Ai14）使Brs3-Cre表達可視化。POA，PVH，DMH，紋狀體末端（BNST），內側后背杏仁核和外側臂旁核的床核tdTomato +神經元的濃度最高（圖1和表1）。而對照組，沒有他莫昔芬治療的則未觀察到tdTomato發表達。

　　原位雜交證明，表達Brs3 mRNA的大多數神經元也表達tdTomato mRNA，反之亦然（圖1）。tdTomato表達模式與之前報道的Brs3 mRNA和配體結合一致。由此研究人員得出結論：Brs3-Cre小鼠中的Cre表達忠實地再現了內源性Brs3表達模式。

（圖1）

　　Brs3定位于X染色體上，Brs3Cre會發生X-inactivation，因此這項研究所有后續研究都使用雄性小鼠。接下來研究人員分析了攜帶Brs3Cre等位基因的小鼠表型。下丘腦Brs3 mRNA表達降低41±3％（圖2），與同窩對照相比，Brs3-Cre小鼠的體重，食物攝入，脂肪量和體重略有增加。這一表型表明Brs3Cre等位基因具有降低的BRS3功能。然而，Brs3-Cre小鼠確實通過增加Tb和減少食物攝入來響應選擇性BRS3激動劑MK-5046（圖2）。 總之，這些數據表明Brs3Cre等位基因屬于亞(效)等位基因，而不是無效突變。

　　2.通過冷暴露，再喂食和瘦素治療激活Brs3神經元

　　研究人員分析了Brs3神經元對影響能量穩態的干預措施的反應激活。結果顯示冷暴露刺激了dDMH-DHA，內側視前區（MPA）和中位前區（MnPO）的Brs3神經元中的c-Fos表達，但不影響PVH，腹側DMH（vDMH）或PBN（圖2）。圖1A，b）。相反，在PVH（PVHBrs3神經元）和PBN中的Brs3神經元中快速增加的c-Fos表達后重新進食，但在dDMH-DHA，vDMH，MPA或MnPO中沒有（圖1）。因此，通過冷暴露和重新進食激活Brs3神經元的不同亞組。

　　Brs3 mRNA富含表達瘦素受體的神經元，因此研究人員分析了瘦素是否激活Brs3神經元。瘦素處理增加了MPA，MnPO，dDMH-DHA和vDMH中Brs3神經元中的STAT3磷酸化，但不增加PVH或PBN（補充圖3a，b），表明這些神經元可能被瘦素激活，可能是直接激活。

（圖2）

　　3.DMHBrs3神經元的光遺傳激活增加Tb，心率和血壓

　　DMHBrs3神經元的光遺傳激活能幫助科學家們在不處理小鼠的情況下研究快速的生理反應，這尤其適合復合檢測心率和血壓。

　　研究人員用AAV-Flex-ChR2-tdTomato（圖4）和對照（AAV-DIO-mCherry）病毒轉導DMHBrs3神經元，在離體切片實驗中刺激DMHBrs3神經元中的通道視紫紅質-2（ChR2）增加神經元放電（圖7）。并且研究人員對清醒小鼠進行了五個周期的研究，其中包括20分鐘的光刺激，然后在激光關閉的情況下60分鐘（圖4）。

　　結果顯示光刺激引發Tb快速強勁的增加，沒有對身體活動產生影響。在mCherry +對照小鼠中未觀察到對應變化。增加刺激頻率產生Tb的劑量依賴性增加（補充圖7）。研究人員的標準刺激使用1秒ON，3秒OFF協議（20 Hz，10毫秒脈沖）。將光劑量加倍（1秒ON，1秒OFF）使Tb的初始增加率加倍（圖7）。因此，這一標準刺激方案不是最大刺激。

　　導致Tb增加的主要效應機制是棕色脂肪組織的交感神經活化，以及血管收縮和行為適應。為了研究DMHBrs3光遺傳激活對BAT熱原的影響，研究人員使用了紅外成像。在基線時，TBAT為35.7±0.08℃，腰椎溫度（Tlumbar）為34.6±0.09℃。DMHBrs3神經元的光遺傳學刺激使TBAT增加1.36±0.16℃（P = 6.8×10-5）和Tlumbar為1.24±0.15℃（P = 8.9×10-5；圖4和圖7）。TBAT最初比Tlumbar快1.90±0.18倍。這些結果表明BAT是Tb增加的驅動因素。

（圖4）

　　4.DMHBrs3→RPa途徑增加Tb并接收來自POA和其他核的輸入

　　研究人員利用AAV-DIO-synaptophysin-mCherry追蹤了DMHBrs3神經元。他們發現DMHBrs3神經元投射到腹外側導水管周圍灰質（vlPAG），伏隔核，藍斑和尾部但不是延髓頭端腹外側區。其他不太密集的受神經支配的大腦區域包括BNST，丘腦的室旁核和弓狀核（弧）。對RPa的DMH投射可刺激BAT，研究人員通過用AAV-Flex-ChR2感染DMH細胞體，并對RPa進行光刺激來測試DMHBrs3→RPa投射增加Tb的能力。

　　結果顯示，刺激DMHBrs3→RPa末端使Tb增加0.43±0.12℃（P = 0.006），對體力活動沒有影響，并且對mCherry對照中的Tb或活性沒有影響（圖5）。因此，選擇性激活DMHBrs3→RPa途徑足以增加Tb，最有可能通過谷氨酸能預測。實際上，DMHBrs3→RPa神經元很少表達Gad2（2.6±0.5％），這是位于后弧的標記（尾至前囟-2.06 mm）。在髓質中，研究人員在孤束核和延髓頭端腹外側區中稀疏的GFP神經元。為了評估從視前區到DMHBrs3→RPa神經元的神經遞質輸入，研究人員進行了ChR2輔助電路映射。他們用AAV-ChR2-EYFP轉染POA神經元，并使用注射在RPa中的HSV-lsl-mCherry識別DMHBrs3→RPa神經元。自此，研究人員發現記錄的大多數DMHBrs3→RPa神經元接受來自POA的GABA能和谷氨酸能輸入（圖7）。這表明DMHBrs3→RPa電路受到POA的動態調控。

（圖7）

　　結論

　　遺傳和藥理實驗證明了BRS3在控制Tb，能量消耗，食物攝入和心率方面的作用。研究人員分析了其中起作用的神經元，結果發現DMHBrs3神經元調節Tb，能量支出和心率，同時不影響食物攝入或身體活動。更具體地說，DMHBrs3神經元通過DMHBrs3→RPa途徑雙向控制Tb，包括對BAT的作用。相反，PVHBrs3神經元控制食物攝入，不影響Tb，能量消耗或身體活動。

　　這些結果指出了Brs3敲除小鼠表型的機制基礎。DMHBrs3神經元失去BRS3可以有助于減少靜息Tb，能量消耗和心率。PVHBrs3神經元中BRS3的缺失可促進食物攝入量的增加。總之，這些機制有助于解釋全球泛濫的肥胖問題。

　　盡管這個模型很簡單，但需要注意的是遺傳Brs3消融僅消除一種受體，而光遺傳學和化學操作操作探測表達該受體的神經元的特性。目前的研究并沒有解決BRS3在神經元中的作用。

　　其他方面也可能有助于調節Tb，能量消耗，心率和食物攝入量。例如，研究人員觀察到PBNBrs3神經元在再喂食期間被激活，這可能表明其在調節食物攝入或信號營養狀態中的作用。類似地，冷環境激活MPABrs3和MnPOBrs3神經元表明這些類型都有助于調節產熱。

　　研究數據表明DMHBrs3→RPa神經元受GABA能和谷氨酸能視前神經元的調節。這還需要進一步的研究來確定哪些POA神經元為DMHBrs3→RPa神經元提供抑制和興奮性輸入。總之，這些研究已經確定了兩個具有單獨功能的Brs3種群：PVHBrs3神經元可以在不影響Tb的情況下穩定地調節食物攝入。DMHBrs3神經元調節Tb，能量消耗，BAT活動，心率和血壓，對食物攝入或身體活動沒有影響。這些數據表明存在專門用于產熱的DMHBrs3→RPa群體。Brs3也可以作為一種神經元標記，用于解剖控制能量穩態的神經回路。