植物生長調節劑是一類具有植物激素活性,可影響植物生長發育的小分子化合物[1]。根據來源的不同,植物生長調節劑可分為天然植物激素和人工合成兩種。按作用方式可分為生長促進劑、生長延緩劑和生長抑制劑。這類化合物在增強植物抗逆性、促進植物細胞分裂與生長、提高產量以及改善品質等方面發揮著重要的作用,為農業生產和發展做出了巨大的貢獻。然而,隨著科技與農業的發展,植物生長調節劑的種類越來越多,應用也日益廣泛,盲目或過量使用的現象時有發生,影響到農產品的品質安全,對公眾的健康造成了潛在的威脅。因此,針對植物生長調節劑各國制定了相應的最大殘留限量(MRL)標準,如日本規定抗倒酯在蘋果、西瓜中MRL為0.02 mg/kg,歐盟規定丁酰肼在蘋果、西瓜中的MRL為0.02 mg/kg,中國規定氯吡脲在葡萄中的MRL為0.05 mg/kg,英國規定矮壯素在西瓜和葡萄中MRL為0.05 mg/kg 等。
目前,國內外有關植物生長調節劑殘留的檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[2,3]、氣相色譜法(GC)[4,5,6]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[7,8,9,10,11]、高效液相色譜法(HPLC)[12,13,14]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[15,16,17,18,19,20,21,22]和離子色譜法(IC)[23]。采用ELISA易產生假陽性,運用GC和GC-MS時通常要進行衍生化的復雜操作,HPLC的靈敏度較低且難以實現確證分析。液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)具有高特異性和高靈敏度,是目前廣泛應用的檢測方法。國內外已有采用LC-MS/MS測定植物生長調節劑殘留的報道,但這些報道所涉及的種類較少,不能滿足國內外快速檢測樣品的要求。本文通過優化質譜參數和色譜條件,考察流動相、提取方法和基質效應等因素,建立了HPLC-MS/MS同時測定水果中21種植物生長調節劑殘留的分析方法。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
Agilent 6460三重四極桿質譜,配Agilent 1290高效液相色譜儀(美國Agilent),Agilent Jet Stream電噴霧離子源(AJS ESI); IKA T18 Basic均質器(德國IKA);離心機(上海安亭科學儀器廠); 固相萃取裝置(美國Supelco)；氮吹儀(美國Caliper)；渦旋混勻器(IKA 3 Basic，德國IKA)；Milli Q超純水系統(美國Millipore)。
乙腈和甲醇(色譜純,德國Merck);甲酸(色譜純,美國Fluka),乙酸銨(色譜純,美國TEDIA),乙酸和氫氧化鈉為分析純;實驗用水符合GB/T 6682規定要求。21種植物生長調節劑標準品:氯化膽堿(choline chloride)、矮壯素(chlormequat chloride)、助壯素(mepiquat chloride)、丁酰肼(daminozide)、赤霉素(gibberellic acid,GA3)、6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)、吲哚-3-乙酸(indol-3-ylacetic acid,IAA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、1-萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)、噻苯隆(thidiazuron)、2,4-D、調果酸(cloprop)、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-triiodobenzoic acid,TIBA)、對氯苯氧乙酸(4-chlorophenoxyacetic acid,4-CPA)、氯吡脲(forchlorfenuron)、環丙酸酰胺(cyclanilide)、抗倒胺(inabenfide)、抗倒酯(trinexapac-ethyl)、多效唑(paclobutrazol)、烯效唑(uniconazole)和抑芽唑(triapenthenol)(純度均大于96% ,德國Dr. Ehrenstorfer)。
稱取適量標準品,分別用甲醇配制成100 mg/L 的儲備液并儲存在-4 ℃冰箱中。根據實驗需要用乙腈稀釋標準儲備液,配成適當濃度的標準工作溶液。
1.2 樣品前處理
稱取10.00 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,勻漿2 min后,加入脫水試劑(4 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉),渦旋振蕩1 min,以 4 000 r/min 離心3 min,取2.0 mL上清液于分散固相萃取管(25 mg C18和150 mg無水硫酸鎂)中,渦旋混勻1 min后于 16 000 r/min 速率下離心5 min,所得上清液經0.22 μ m有機濾膜過濾后,待測定。
 | 表1 21種植物生長調節劑的質譜分析參數Table 1 MS/MS parameters of the 21 plant growth regulators |
1.3 HPLC-MS/MS條件
色譜柱:Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m)。流動相A: 5 mmol/L 乙酸銨-0.05%(v/v)甲酸水;流動相B:乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min,5%B; 2～12 min,5%B～80%B; 12～18 min,80%B; 18.1 min,5%B; 18.1～24 min,5%B。流速:0.5 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:5 μ L。采用AJS ESI源,正離子、負離子分段多反應監測模式(MRM)檢測(其中第1段:0～5 min,正離子掃描;第2段:5～13 min,負離子掃描;第3段,13～24 min,正離子掃描)。霧化氣壓力:310.3 kPa;噴嘴電壓:500 V;干燥氣溫度與流速:300 ℃,10 L/min;鞘氣溫度與流速:375 ℃,11 L/min;毛細管電壓:4 000 V。21種植物生長調節劑的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數見表1。
2 結果與討論
2.1 質譜條件優化
使用單針自動進樣分析目標化合物的標準溶液,優化21種植物生長調節 劑的質譜條件。化合物進入一級質譜后,可產生穩定的[M+H]+離子或[M-H]-離子。其中6-芐氨基嘌呤、噻苯隆、氯吡脲和抗倒胺可產生[M+H]+離子,也可以形成穩定的[M-H]-離子,在綜合考慮靈敏度與分段掃描等因素后,最終選用6-芐氨基嘌呤、噻苯隆和氯吡脲的[M-H]-離子為母離子,抗倒胺的[M+H]+離子為母離子;確定了化合物母離子后,在SIM模式下,對化合物的Fragmentor(碎裂電壓)進行優化;母離子進入二級質譜,發生斷裂或重排等反應產生不同的離子碎片。在Product Ion模式下,對化合物母離子施加一定量的碰撞能量(CE),得到其相應的離子碎片;最后在MRM模式下,優化目標物離子碎片的最佳碰撞能量。21種植物生長調節劑的二級離子質譜圖見圖1,MRM色譜圖見圖2。
2.2 色譜條件優化
實驗對比了Thermo Accucore-C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m)、Phenomenex Kinetex-C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μ m)和Agilent XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m)色譜柱對待測物分離的效果。 由于21種待測物的極性差異較大,極性較強的丁酰肼、矮壯素、助壯素和氯化膽堿在反相色譜柱上的保留較弱,且在Thermo Accucore-C18和Phenomenex Kinetex-C18的保留時間均小于2 min,而在Agilent XDB-C18柱上的保留大于2.5 min。因此,選取了Agilent XDB-C18色譜柱來分析待測物。
分析物的測定采用正離子和負離子模式,本研 究采用的質譜儀毛細管支持正負模式快速切換。試驗比較了分段與不分段對待測分析物靈敏度的影響,如圖3所示,采用分段的方法分析物的分離度與峰形較好,同時也提高了大部分待測分析物的靈敏度。因此,本研究通過對流動相與洗脫梯度的優化后,以不同的離子掃描模式將分析監測過程分為3段。
 | 圖1 21種植物生長調節劑的二級離子質譜圖Fig. 1 MS/MS spectra of the 21 plant growth regulators1. choline chloride; 2. chlormequat chloride; 3. mepiquat chloride; 4. daminozide; 5. GA3; 6. 6-benzylaminopurine; 7. IAA; 8. ABA; 9. NAA; 10. thidiazuron; 11. 2,4-D; 12. cloprop; 13. trilodobenzoic acid; 14. 4-CPA; 15. forchlorfenruon; 16. cyclanilide; 17. inabenfide; 18. triexapac-ethyl; 19. paclobutrazol; 20. uniconacole; 21. triapenthenol. |
 | 圖 2 21種植物生長調節劑的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the 21 plant growth regulators1. choline chloride; 2. chlormequat chloride; 3. mepiquat chloride; 4. daminozide; 5. GA3; 6. 6-benzylaminopurine; 7. IAA; 8. ABA; 9. NAA; 10. thidiazuron; 11. 2,4-D; 12. cloprop; 13. trilodobenzoic acid; 14. 4-CPA; 15. forchlorfenruon; 16. cyclanilide; 17. inabenfide; 18. triexapac-ethyl; 19. paclobutrazol; 20. uniconacole; 21. triapenthenol.s |
 | 圖 3 分段采集模式和正負離子快速切換模式對化合物分離效果的影響Fig. 3 Effect of separation of compounds in segment mode and quick swiching modea. segment mode; b. quick swiching mode. |
液相色譜-質譜分析中有機相通常使用乙腈,水相常使用甲酸水溶液、乙酸銨水溶液或甲酸-乙酸銨水溶液。通過試驗對比,使用同時含5 mmol/L 乙酸銨和0.05%(v/v)甲酸時,待測物的分離度和峰形都比較好。因此,本文選擇流動相水相為含5 mmol/L 乙酸銨和0.05%(v/v)甲酸的水溶液,有機相為乙腈。
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