(2)擴增結果差,條帶模糊或難以辨認。
――更換Taq聚合酶緩沖液。
――檢查引物(使用另外一個引物,或者將引物末端標記,在 16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺膠上電泳檢測)。
――檢查Taq聚合酶活性(與不同批量的酶作比較)。
――改變DNA濃度。
(3)高相對分子質量產物彌散狀分布>4kb。
――降低DNA濃度。
――降低Taq聚合酶濃度。
――減少凝膠上樣量。
―― 可能是由于循環數過多的結果(Bell和Demarini 1991),減少循環數。
――確認是否使用正確的緩沖液(不是水!)制備凝膠。
―― 在較低的電壓下電泳。
(4)在對照和所有檢測樣品中均為一條很強的單一帶。
――確認引物序列不是回文結構。這可能是引物多聚體造成的結果。使用不同的引物。
(5)帶譜不可重復。
――DNA過多或過少。把基因組DNA濃度控制在10~100ng范圍之內,DNA量太少時,“真正”靶序列與引物的結合效率低,因此引物擴增會產生假的條帶,這就稱為引物偽跡;DNA量太多會導致錯誤配對(指引物與基因組DNA的配對)。每個樣品進行兩個不同DNA濃度的反應。
――只考慮主要條帶。
(6)染色后凝膠背景太強影響分辨率。
―― 減少染色時間。
――凝膠脫色時間延長。
――PCR反應中DNA含量或Taq聚合酶過多。
(7)低相對分子質量產物分離不充分。
――在更高濃度的瓊脂糖凝膠、專業純凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離產物。
5 RAPD分析的優越性和不足
RAPD是一種全新且有效的遺傳標記,與其他分子標記相比,具有許多優越之處:
①合成一套引物,可用于不同生物基因組的分析。相對來說,RFLP標記具種族特異性,這限制了其應用。
②RAPD技術簡便易行,省力省時。不需要RFLP分析的預備工作,如克隆制備、同位素標記、Southern印跡和分子雜交。并且RAPD檢測靈敏方便,用熒光染料或同位素標記均可檢測,這大大增加了其分析速度。即使用序列膠來分析RAPD,單獨一人僅用36小時便能完成120個樣品的分析,而RFLP至少要花一周時間。
③RAPD分析所需樣品DNA量極少。僅為RFLP的1/1000~1/200,這對于生物早期取樣鑒定或DNA受限制的情況大有益處。
④由于RAPD用于構建基因圖譜時不需要克隆,這可打破克隆載體和宿主的限制,擴大了應用范圍。
⑤每個RAPD標記相當于基因組分析中的靶序列位點,這對共同協作的研究項目,可簡化信息的轉移過程。
⑥RAPD標記可以對那些RFLP難以區分的基因組區域作出遺傳連鎖圖。⑦RAPD分析能自動化,減少了象RFLP那樣的麻煩手續。
然而,RAPD標記也存在某些不足。比如,RAPD標記難以區分開雜合子和純合子基因型,不能有效的鑒別出雜合子。另外,RAPD反應易受外界因素影響,重復性不太令人滿意,等等。因此,使
RAPD實驗條件標準化就很重要了。Black(1993)綜述了一些影響條帶的書目、大小和強度的因素,其中包括PCR緩沖液。dNTP和Mg2+濃度、循環參數(退火溫度、變溫時間、PCR儀)、Taq聚合酶來源(Schierwater和Ender,1993)、DNA條件和含量(Black
等,1993)。
6 RAPD分析在分子生藥學中的應用
目前,RAPD標記已被廣泛應用于分子生藥學各方面:
①生物多樣性:隨著植物藥研究的不斷深入,可持續開發利用藥用植物資源的問題越來越受到重視。應用RAPD技術進行藥用植物生物多樣性研究,可以在遺傳多樣性水平上了解天然產物多樣性與物種、生態及地理分布的關系,挖掘潛在的藥物資源,為開發新藥尋找途徑。RAPD方法可以檢測物種的遺傳多樣性,探討物種的親緣關系和進化趨勢。因此它是藥用植物資源保護和種質資源保存的依據,特別是對瀕危物種的研究更具有實際意義。(舒艷群,
白守梅, 陳毓亨. RAPD技術在藥用植物研究中的應用. 中草藥, 1999,30(2):147)
②RAPD標記可用于生藥分類,在 DNA分子水平上鑒別生物不同種、亞種、變種甚至株。
③RAPD標記可用來制作生物類生藥系統發育關系上的樹狀圖,特別是種內水平。這為生藥親緣進化關系,尋找新的藥用資源開辟了新途徑。
④RAPD標記可用于構建基因圖譜,進行基因定位,和對未知序列的DNA片段擴增與測序。
⑤RAPD 標記亦可用于遺傳連鎖圖譜的構建,指導藥用植物育種,防止品種間雜化和自交,選育優良性狀的品種。