RNAi的作用機制及siRNA的合成方法（一）

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double strandedRNA， dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列基因表達或使其沉默的過程。dsRNA可以抑制不同類型細胞的靶向基因表達，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達的蛋白質。因此，RNAi技術又被形象地稱為基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)。RNAi是一種典型的轉錄后基因調控方法，又稱轉錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)^[1]。

1 RNAi技術的發展過程

    早在1990年，植物學家Jorgensen等人用矮牽牛花做試驗，將紫色素合成基因導入植物體，嘗試將更多拷貝的色素基因注入植物體，使花朵的色彩更加艷麗。結果許多花朵沒有開出更艷麗的花朵，反而開出白色的花朵。進一步分析發現，這些轉入的基因不但自身沒有表達為蛋白質，反而關閉了牽牛花中與其同源的色素相關基因的表達。由于這種由外源基因的導入而造成的抑制作用最初被確認是發生在轉錄后水平，稱這種現象為共抑制(cosuppression)^[2]。1994年，Cogoni等人將外源性類胡蘿卜素基因導入野生型粗糙鏈孢霉菌，結果轉化細胞中內源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制，他們稱這種基因失活形式為消除作用或基因壓制(quelling)^[3]。1995年康乃爾大學的Guo^[4]博士在實驗中想通過反義RNA阻斷美麗線蟲(C. elegans)的par-1基因表達，同時還用正義RNA做了一個對照，試圖觀察到對照試驗組基因表達增強的現象，但結果卻發現了反義和正義RNA都阻斷了該基因的表達，Guo等人一直不能解釋該現象。直到1998年Fire等^[5]才發現這是由于Guo博士在試驗中污染了雙鏈RNA而引起的。他們還證明轉錄得到的單鏈RNA經純化后注射線蟲所引起的阻斷作用十分微弱，而經純化的雙鏈RNA則能高效特異地阻斷相應基因的表達，他們將此現象稱為RNA干擾。1999年， Hunter^[6]等的實驗進一步驗證了RNAi的存在。他們將dsRNA去除后，再將正義或反義的ssRNA注入線蟲卵中，沒有產生基因沉默現象。相反，如果將上述正義及反義ssRNA混合，經退火復性后得到的dsRNA注入線蟲卵中可以顯著地產生基因沉默現象，從而印證了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的結論。2000年首次在果蠅中發現，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為21～23 nt的短片段。2001年，首次報道了哺乳動物細胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發夾結構RNA（shRNA）在哺乳動物細胞中可以誘導特異性的基因沉默^[7]。2003年首次用RNAi技術對模型動物進行了治療研究^[8]。2006年諾貝爾醫學獎沒有堅持研究成果要經過數十年實踐驗證的“慣例”，破格授予美國科學家安德魯?菲爾和克雷格?梅洛，以表彰他們1998年發現了RNAi現象。此后，人們在不同種屬的生物中進行了廣泛而深入的研究，結果證實dsRNA介導的RNAi現象存在于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、渦蟲、水螅、斑馬魚、小鼠、大鼠、猴乃至人類等多種生物中^[2]。

2  RNAi的作用機制

    目前關于基因沉默的假說認為，轉錄后水平的基因沉默，主要包括起始階段、效應階段和倍增階段。

2．1 起始階段

    外源性導入或由轉基因、轉座子、病毒感染等多種方式引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)， 在細胞內特異性與RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸內切酶) Dicer結合，dsRNA被切割成21~23nt長度的帶有3′端單鏈尾巴及磷酸化的5′端的短鏈dsRNA，即小干擾RNA(siRNA)。（以下圖片均來自于陳莉等的文章《在醫藥領域中RNA干擾研究進展》）

2.2 效應階段

    雙鏈siRNA可以與含Argonauto（Ago）蛋白的核酶復合物結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在ATP供能情況下，激活的RISC將siRNA的雙鏈分開，RISC中核心組分核酸內切酶Ago負責催化siRNA其中一條鏈去尋找互補的mRNA鏈，然后對其進行切割。反義鏈先與同源mRNA配對結合，然后RISC在距離siRNA 3'端12個堿基的位置將mRNA切斷降解，從而阻止靶基因表達，使基因沉默^[9]。