RNAi的作用機制及siRNA的合成方法

RNAi的作用機制及siRNA的合成方法
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double strandedRNA， dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列基因表達或使其沉默的過程。dsRNA可以抑制不同類型細胞的靶向基因表達，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達的蛋白質。因此，RNAi技術又被形象地稱為基因敲除(knock out)或基因沉默(gene silencing)。RNAi是一種典型的轉錄后基因調控方法，又稱轉錄后基因沉默(post tracriptional gene silencing，PTGS)[1]。
1 RNAi技術的發展過程
早在1990年，植物學家Jorgeen等人用矮牽牛花做試驗，將紫色素合成基因導入植物體，嘗試將更多拷貝的色素基因注入植物體，使花朵的色彩更加艷麗。結果許多花朵沒有開出更艷麗的花朵，反而開出白色的花朵。進一步分析發現，這些轉入的基因不但自身沒有表達為蛋白質，反而關閉了牽牛花中與其同源的色素相關基因的表達。由于這種由外源基因的導入而造成的抑制作用最初被確認是發生在轉錄后水平，稱這種現象為共抑制(cosureion)[2]。1994年，Cogoni等人將外源性類胡蘿卜素基因導入野生型粗糙鏈孢霉菌，結果轉化細胞中內源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制，他們稱這種基因失活形式為消除作用或基因壓制(quelling)[3]。1995年康乃爾大學的Guo[4]博士在實驗中想通過反義RNA阻斷美麗線蟲(C. elega)的par-1基因表達，同時還用正義RNA做了一個對照，試圖觀察到對照試驗組基因表達增強的現象，但結果卻發現了反義和正義RNA都阻斷了該基因的表達，Guo等人一直不能解釋該現象。直到1998年Fire等[5]才發現這是由于Guo博士在試驗中污染了雙鏈RNA而引起的。他們還證明轉錄得到的單鏈RNA經純化后注射線蟲所引起的阻斷作用十分微弱，而經純化的雙鏈RNA則能高效特異地阻斷相應基因的表達，他們將此現象稱為RNA干擾。1999年， Hunter[6]等的實驗進一步驗證了RNAi的存在。他們將dsRNA去除后，再將正義或反義的RNA注入線蟲卵中，沒有產生基因沉默現象。相反，如果將上述正義及反義RNA混合，經退火復性后得到的dsRNA注入線蟲卵中可以顯著地產生基因沉默現象，從而印證了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的結論。2000年首次在果蠅中發現，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為21～23 nt的短片段。2001年，首次報道了哺乳動物細胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發夾結構RNA（shRNA）在哺乳動物細胞中可以誘導特異性的基因沉默[7]。2003年首次用RNAi技術對模型動物進行了治療研究[8]。2006年諾貝爾醫學獎沒有堅持研究成果要經過數十年實踐驗證的“慣例”，破格授予美國科學家安德魯?菲爾和克雷格?梅洛，以表彰他們1998年發現了RNAi現象。此后，人們在不同種屬的生物中進行了廣泛而深入的研究，結果證實dsRNA介導的RNAi現象存在于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、渦蟲、水螅、斑馬魚、小鼠、大鼠、猴乃至人類等多種生物中[2]。

2 RNAi的作用機制

目前關于基因沉默的假說認為，轉錄后水平的基因沉默，主要包括起始階段、效應階段和倍增階段。

2．1 起始階段

外源性導入或由轉基因、轉座子、病毒感染等多種方式引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)， 在細胞內特異性與RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸內切酶) Dicer結合，dsRNA被切割成21~23nt長度的帶有3′端單鏈尾巴及磷酸化的5′端的短鏈dsRNA，即小干擾RNA(siRNA)。（以下圖片均來自于陳莉等的文章《在醫藥領域中RNA干擾研究進展》）
2.2 效應階段

雙鏈siRNA可以與含Argonauto（Ago）蛋白的核酶復合物結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在ATP供能情況下，激活的RISC將siRNA的雙鏈分開，RISC中核心組分核酸內切酶Ago負責催化siRNA其中一條鏈去尋找互補的mRNA鏈，然后對其進行切割。反義鏈先與同源mRNA配對結合，然后RISC在距離siRNA 3'端12個堿基的位置將mRNA切斷降解，從而阻止靶基因表達，使基因沉默[9]。
2.3 倍增階段

siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA為模板，siRNA為引物，擴增產生足夠數量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產生更多的siRNA， 可再次形成RISC，并繼續降解mRNA，從而產生級聯放大效應。并作用于靶mRNA。如此反復倍增，從而使RNAi的作用進一步放大。因此少量的siRNA就可以產生高效的基因沉默效果[10]。

3 RNAi的設計及合成

3.1 siRNA的設計

設計高效率的siRNA首先要通過NCBI、DDBJ、BMBL這3個基因序列數據庫，檢索相關的基因序列，獲得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理設計siRNA。常規siRNA的設計原則是以成熟的mRNA為標準，若以DNA序列為參照，則最好選擇cDNA轉錄區+50到+100以后的下游序列，兩端的非翻譯區不作為siRNA設計依據。siRNA二聚體的正義鏈和反義鏈各含21nt為佳，3'端為突出末端。3'凸端為尿苷(U)，5'凹端為腺苷(A)的mRNA序列應作為首選。進行Gen-Bank BLAST查詢，確保所選siRNA編碼不與其它基因同源[11]。不是mRNA的所有亞單位都能形成有效的siRNA，大約有60%~70%可以發揮沉默效應， 這是由于5‘和3’-UTR有豐富的調控蛋白結合區域，產生UTR結合蛋白或翻譯起始復合物均可能影響RISC結合mRNA，從而影響siRNA的效果，所以沉默效應率差異較大，針對一個靶基因需要設計3~4條siRNA，以保證能夠篩選出一條有效序列[12]。

3.2iRNA的合成方法

制備siRNA的方法主要有化學合成法、體外轉錄法、酶消化法、體內轉錄法等。當已經找到最有效的siRNA時，適合以核苷酸單體為原料，通過化學方法合成兩條互補的長約21~23 nt的RNA單鏈，然后退火形成雙鏈復合體，這種方法所獲得的產物純度、干擾效率高，合成簡單，但是制備周期長，作用時間短，而且價格昂貴限制了其應用和推廣[13]。體外轉錄法[14]是以兩段互補的DNA為模板， 在針對靶序列的正義鏈和反義鏈上游接上T7啟動子，使用T7 RNA聚合酶，各自在體外轉錄獲得兩條單鏈RNA，將兩條單鏈退火后形成雙鏈RNA，然后用RNA酶消化，所得產物經純化后就是所需的雙鏈RNA，此方法適用于篩選有效的siRNA，但不適用于對特定siRNA進行長期研究。酶消化法[15]是先在體外化學合成200~1000 完整的目的基因長片段dsRNA， 用細胞內形成的siRNA關鍵酶-Dicer酶或者RNaseⅢ進行消化，即可得到各種不同的針對同一目的基因的不同位點的siRNA混合物，然后將混合物轉染至細胞內，能得到較高的抑制效率。該方法抑制率高，且省時省力， 但此法產生的混合物可能導致非特異性抑制，另外在體外轉錄長鏈RNA有困難，Dicer酶費用較高[16]，此方法不適用于長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療。體內轉錄[17]是將siRNA的質粒、病毒表達載體或帶有siRNA表達盒的PCR產物轉入細胞，由細胞表達產生RNA干擾作用。siRNA表達載體常用能在哺乳動物細胞中表達shRNA的含有RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)啟動子的載體[18] ，通過轉染含有RNA聚合酶II/III的啟動子U6或H1，及其下游一小段特殊結構的質粒或病毒載體到宿主細胞內，轉錄出shRNA，該RNA在細胞內被Dicer酶剪切成siRNA而發揮作用。該方法的優點是細胞特異性強，適用于基因功能的長時間研究[2]。siRNA表達框(siRNA expreion caettes， SECs)[17]是一種由PCR制備的siRNA表達模板，可直接轉入細胞進行表達而無需事先克隆到載體中。利用引物延伸法進行PCR，產生包含1個RNA聚合酶III啟動子U6或H1、一小段編碼shRNA的DNA模板和1個RNA聚合酶III終止位點的表達框架，然后直接轉染到細胞內。該方法為篩選有效的siRNA片段和合適的啟動子提供了較為便捷的工具[2]。其主要缺點是PCR產物轉染細胞的難度大，如有轉染試劑能提高SECs的轉染效率，這一方法將得到更為廣泛的應用。