RealtimePCR實驗心得和RNA提取心得

并不是所有的實驗都可以做real－time的，技術路線要選好

當你的基因表達量少或有些不表達

具體就是做普通pcr跑膠條帶比較弱，不是很亮的情況下

個人覺得最好不要選擇real，不容易做好，特別是融解曲線

用sbgr green染料做的話，引物設計時擴增片斷最好小于250bp，太長了不好擴

預實驗先rt－pcr，梯度溫度擴增，尋求最佳退火溫度。

并確定有較亮的目的條帶

試劑盒不能太差，要省錢的話可以把體系降到20ul

最好不要用普通的pcr試劑盒＋sbgr green來作real，

可以做出來，但是不穩定，很耗時間精力

上下游引物可以混在一起，摸條件時加樣比較方便，如果要批量的話，最好是分開的好些。

如果用的是普通pcr的ep管，可以把蓋子剪掉，再加入20ul的石蠟油或礦物油封住液面，效果比較好，當然要確定你的機子是從蓋子上面檢測熒光的，而不是從側管壁。

融解曲線不好，特別是有目的條帶高峰，但前面65－75度峰也較高時，可以再做一次融解曲線，一般都會變好一點，不過最好是把條件優化

重做融解的對比圖，有時候這是機子，還有熒光的不穩定造成的
Real比較敏感，融解曲線不太好的時候，電泳結果也可以，所以對引物設計要求高些。如果條件優化很多次都好不了，那最好就換個引物了
附RNA提取心得

提取步驟：invitrogen的RNA提取試劑盒trizol，紅色，100ml

1，取組織50－100mg，加入trizol試劑1ml，剪碎組織塊，勻漿5－15分鐘，后放室溫裂解5分鐘

2，4度，12000rpm離心10分鐘，換新ep管，取上清

3，按200ul/ml的trizol加入氯仿（1/5的體積），手動劇烈振蕩15秒，后室溫放置3分鐘

4，4度，12000rpm離心15分鐘

5，取上清至新ep管，注意少震動，少吸，一般400ul，不能吸入中間絮狀物質

6，按500ul/ml的trizol（等體積的，那就是400ul）的加入異丙醇（預冷），室溫10分鐘

7，4度，12000rpm離心10分鐘，棄上清，應該可以見到白色沉淀

8，加入75%的乙醇1ml洗滌，懸浮沉淀

9，4度，7500rpm離心5分鐘

10， 去上清，風干，5分鐘左右

11， 加入DEPC處理過的無酶水20－40ul，吹打融解沉淀，－70度保存

如果不是提特殊組織（如胰腺），好像也不是很難提，RNA也不是那么容易降解的。

我們經常口罩帽子都不戴，也沒事。但是關鍵步驟一定要注意，小心。

組織要勻漿好，可以把組織剪碎，剪刀我們也沒處理，盡快吧，加入trizol以后就沒事了，它可以抑制RNA降解的。一般就4－5分鐘，組織塊成白色的就行了。室溫裂解可以多放幾分鐘。

第5步比較關鍵，中間層一定不要吸。操作要輕柔，防止中間層飄起。

第7步就可以看見沉淀了，沉淀多，后面的水就多加些（40ul），如果沒看見沉淀，加水10ul就可以了，有些是有的，只是量太少了看不見。

提RNA最好一次提完，也就3個小時左右，不要提一半后保存

提完后測個濃度盡快逆轉錄

我們沒跑電泳，后面也可以做