SELDI蛋白質純化鑒定

實驗目標

針對血清、血漿、體液、組織、真菌、細菌、細胞培養物以及植物等樣本的差異蛋白質組研究，以蛋白質芯片為載體，通過對目標疾病樣本組及對照組之間進行鑒定，以期找到能夠區分不同組別的差異峰，并通過對差異峰進行蛋白質鑒定找到與目標疾病密切關聯的基因/蛋白。 

實施方案    

一、目標蛋白

1.利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片系統尋找出蛋白表達譜中有意義的差異蛋白。

2.篩選符合p<0．05為統計學有顯著性差異蛋白或由BPS聚類軟件計算得出的診斷模型組成蛋白。

二、目標蛋白的分離純化

1.利用白蛋白/IgG去除試劑盒去除樣本中高豐度蛋白。

2.利用分子篩K30-100去除樣本中的分子量大于30-100Kda的蛋白。

3.利用與先前SELDI蛋白表達譜所用的蛋白質芯片相一致的納米磁珠吸附包含目標蛋白在內的一類蛋白（如SELDI表達譜所用WCX2芯片則選用WCX磁珠）。

4.蛋白濃縮，將吸附后的蛋白液體匯集到EP管置于冷凍干燥機凍干8小時，即得到蛋白凍干干粉。

5.蛋白定量，總蛋白量需達到50-100ug，入量不夠可繼續按之前步驟增加樣品用量。

6.Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine -SDS-PAGE）。

三、膠內蛋白質原位酶解和質譜鑒定

1.選取考馬斯亮藍染膠上的蛋白條帶，同時切下一個陽性對照點和陰性對照點（空白膠），用去離子水充分洗滌。

2.用含50％乙腈的25 mmo1碳酸氫銨溶液脫色3次，然后用乙腈吸干膠中的水分，膠粒自然揮發干燥。

3.經二硫蘇糖醇（DTT）還原和碘乙酰胺（IAA）烷基化后，膠粒用乙腈脫水后自然揮發干燥；加入用25 mmo}／L碳酸氫銨溶液配成的適量胰蛋白酶溶液于各管中，室溫1小時后吸出酶溶液，再加入適量 25 mmol／L碳酸氧銨溶液使膠粒保濕，37℃保溫12 h。

4.吸出上清，加入5％三氟乙酸，50％乙腈溶液40℃保溫1 h，重復1次，合并上清，自然揮發干燥至溶液終體積為5ml。

5.基質選用Ⅱ一氰基一13一羥基肉桂酸，飽和地溶解在30％乙腈、lO％丙酮和0.1％的三氟乙酸中，用Bruker公司肽混合物作為外標。質譜采用Bruker公司BIFLEX型基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS），在延遲解吸和反射模式下進行譜圖的采集。

6.使用搜索引擎（http://www.matrixscience.com） Mascot在NCBI數據庫中搜索，zui終確定蛋白質的相關信息。

四、目標蛋白的免疫學驗證

（一）酶聯免疫吸附測定（ELISA）驗證鑒定出的蛋白質

1.樣本處理：室溫血清自然凝固10-20分鐘，3000rpm離心20分鐘，收集上清。

2.標準品的稀釋與加樣。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30被濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50ul,空白孔除外。

7.溫育、洗滌同上。

8.顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

9.終止：每孔加終止液50ul，終止反應。

10.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

（二）免疫沉淀（Immunoprecipitation）和蛋白質芯片檢測

1.取同一份血清樣本20ul,分成a、b兩等份。

2.a份加入目標蛋白的ELISA Kit孔中，并且入40ul樣品稀釋液，溫育30分鐘。

3.30分鐘后分別在a、b血清樣本中加入PH=4.0的NaAc350ul和390ul，置振蕩器400-600轉/分, 4℃震蕩1小時。

4.洗脫2次，芯片加樣并讀取數據。