TGFf3／Smad信號通路相關蛋白表達

尸檢胰腺標本

Smad抗體 TGF-13R I抗體

石蠟切片 組織芯片構建儀

一、收集病例資料

收集2001年1月——2003年12月第二軍醫大學附屬長海醫院病理科資料較完整的手術切除及同期尸檢胰腺標本計250例。復讀全部病理切片，根據PanlN最新概念和診斷標準，檢出切片中全部PanlN病灶，共計351灶，分布于156例中。這156例包括導管腺癌121例、慢性胰腺炎23例，正常胰腺12例。其中，男性93例，女性63例，年齡3O——8O歲，平均58.6歲。121例胰腺導管腺癌中，發生于胰頭部的有92例，胰體尾的27例，全胰的為2例。病理上屬于高分化的有21例，中分化68例，低分化32例。

二、組織芯片構建

找出存在PanlN病灶的HE切片和相應存檔的組織蠟塊，先在切片PanlN病灶處用記號筆作好標記，比對蠟塊，在對應點同樣作好標記。組織芯片構建參照Kononen等建立的方法，應用組織芯片構建儀（Tissue Arrayer，Beecher Instruments，Silver Spring，MD，USA）制備組織芯片。

流程如下：

1. 應用構建儀在預先制備的空白蠟塊（45 mm x20 mm）中穿孔（直徑2 mm，深度2——3 mm），然后在組織蠟塊標記點處穿取組織（直徑及深度同上），準確放入空白蠟塊的小孔內，依次按序操作，直至完成，并加以記錄。

2. 然后對制備好的芯片蠟塊進行處理，使嵌入的組織條與蠟塊密切融合。

3. 最后應用石蠟切片機進行連續切片。

三、免疫組化染色

2——4 m厚石蠟切片，免疫組化采用S-P法和EnVision二步法，用PBS替代一抗作陰性對照，DAB顯色。Smad2、3、4、7抗體購自Santa Cruz公司，TGF.131、TGF.13R U抗體購自武漢博士德公司，TGF-13R I抗體購自Cell SignalingTechnology公司。

四、結果判定

染色結果參照有關文獻的判定標準并略加修改，Smad2、3和TGF一131以胞質內出現明顯棕黃色顆粒為陽性；Smad4、7則以胞質和（或）胞核內出現明顯棕黃色顆粒為陽性；TGF-13R I，TGF.13RII以胞膜和（或）胞質中出現棕黃色著色為陽性。上述指標均以陽性細胞數>10％ 為陽性病例，陽性細胞數≤10％者為陰性病例。

五、統計學處理

數據采用SPSS統計軟件行x2檢驗

本實驗步驟參考《用組織芯片和免疫組化技術系統比較不同級別PanIN和胰腺癌組織TGF-13/Smad信號傳導通路中相關蛋白表達》的內容