WesternBlot詳解－常見的問題指南（四）

9. 條件的摸索

DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實驗過一抗和二抗肯定能結合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時轉膜后，麗春紅染色發現大分子量蛋白轉過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V，3-4小時。
3、轉膜，建議恒壓，15V，不用轉2小時，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾經也轉過2小時，但和45分鐘的區別并不大。
4、根據MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當加大1抗濃度。
6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質量還可以，我想您應該先找其他方面的原因。

EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。
解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時溴酚藍和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時間。建議你用恒壓80－100伏。

FFF. BIO-RAD的半干轉運系統有一個很致命的弱點就是無法控溫（我用的就是這種），當電流過高，而系統的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。
就轉膜時，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個系統用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來轉膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩定在40mA，不就相當于恒流嗎？
解答：恒流時電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠40cm2，不知有無不同。

GGG. 我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉膜，下半時間短，上半時間長一點，應該會好一些。

HHH. 請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時上樣分離，應如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊？3、濕式轉移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉移的條件如何確定，因為我要分離小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質，轉移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個線形范圍，是不是不在這個范圍內也能分離，只是就不是線性范圍了？
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們在一個月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。
3、轉移時一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉移條件是和蛋白質大小有關的：以次確定電壓和時間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質大小有關。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。

JJJ. 怎樣設計實驗來確定最佳的條件？
解答：隨便說一點， 具體的還是需要自己想：
1、在每個上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1 個大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-page；
2、轉移， 設定電流或電壓；
3、每隔 1（or n） 小時，取一點膜染色，看轉移效果。

KKK. 我要測兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒什么效果？
解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。

LLL. 1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復合物時，每次要重懸多長時間合適？2、最后用2xSDS重懸抗原-抗體復合物離心后，由于2XSDS中已經加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時也不知道里面是否吸進了Agarose。不知有什么方法可以解決這個問題，或者即使吸進了一些Agarose也不要緊呢？
解答：1、不用重懸多久，重懸起來了就可以離心了。
2、加2X BUFFER前大體上已經知道有多少膠粒了，吸到那個位置時小心點就是了。我也試過一些次，首先離心稍微長一點，長20秒吧，希望膠粒能沉得結實點（我想象的），再吸取。如果感覺槍頭不是很順暢的時候可能就是碰到膠粒了。很難一點膠粒也吸取不上來的，盡力做好就是了。

MMM. 磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。我做的時候從未加過，都做出來了。

NNN. Western Blot中block的最短時間?
解答：每一步1小時足夠了， 中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時間10分鐘就夠，洗3次只要半小時。跑膠1小時， 轉移1小時，block半小時就行，1抗1小時，洗半小時，2抗1小時，洗半小時，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色， 一塊western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。

OOO. 想用Western檢測基因轉染后細胞培養上清中表達的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？
解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：
1、轉移時的時間，
2、轉移時的電流或電壓.
3、transfer buffer 中加20%的甲醇.
4、可以用13-15%的分離膠.

PPP. 蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉，請問多大電流，多長時間比較合適？
解答：分子量比較小，最好是用干轉，濕轉效率太高，易轉過了。干轉的話，用2.5 A/cm2， 30min就應該夠了。濕轉，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。

QQQ. 需要測同一種蛋白質的總量與磷酸化的量，但相互間干擾太大，怎么辦？
解答：將膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巰基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分鐘，TTBS西三次，再重新加入一抗，進行另一種抗原的檢測。

RRR. 做Western Blot實驗時，發現轉膜時的電流總是偏小，轉膜的效率也偏低. 100V恒壓轉膜時的電流只有190mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一樣，只是環境溫度比以前低了很多。
解答：有可能重復使用了轉移緩沖液，隨著離子的逐漸減少，電阻越來越大，當然恒壓時電流越來越小了。建議更換轉移緩沖液。反復使用不要超過三次。環境溫度低是有利于轉移的。

SSS. 我電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出在抗原和一抗上，不知對不對。一抗我買的是單抗，推薦的稀釋度是1：100——1：1000。我用的是1：100。難道非要用多抗嗎？按道理單抗也應該出條帶呀！細胞用三去污劑裂解的，沒有做定量，加巰基乙醇變性后，每孔上樣20微升。提出的蛋白我保存在4度了，這樣行嗎？
解答：1、建議您用恒壓進行電泳，先用70V，等跑過積層膠與分離膠的界限時，換用90-100V，再跑3小時左右。2、轉膜可用恒流，但要根據你的膜的面積及所要檢測的蛋白的分子量的大小來確定電流的大小，一般來講，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的電流大些，譬如，你膜的面積是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的條件進行，你就可以60mA的電流進行。3、我覺得你的抗體應該沒問題。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我們實驗事都是保存在-20度的，提出蛋白分裝保存在-20度。

TTT. 目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％T丙稀酰胺（2.6％C）濃度為16.5％，另外兩層都用30％丙稀酰胺，中間一層濃度為10％，積層膠濃度為4％，凝膠厚度1mm，轉膜的條件試過30V70分鐘，膜上可見到小分子蛋白marker的條帶，似乎見到目的條帶，上樣量為60μg細胞胞漿總蛋白，轉膜的條件怎么樣合適？
解答：一定要用0.2μm的膜，并且轉移的條件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根據你的實驗器材來定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應的分子量大小的marker轉移的好就可以了。

UUU. 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會跑的好些?還有前面有人說電泳液平玻璃板會使電泳條帶漂亮些?
解答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠菇翰瘓取?/P>

VVV. 為什么提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?
解答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。

WWW. 上次轉染了1.6*106細胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進分離膠，在100v電泳至溴酚蘭出膠，biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘，預染marker全部進膜，轉移后的膠考馬斯亮蘭染，可見殘留的蛋白帶，大分子量多些.blot時，封閉用5%奶粉TTBS 1小時，抗體稀釋液TTBS，一抗(1:10，單抗上清，2000年制備)1小時，二抗(1:2000)1小時，均在室溫.結果，50kd的小分子顯色，160kd大分子未顯色。
原因分析及準備改進：轉染大容量的質粒(融合蛋白的質粒)的效率會相對較低，大分子量表達也會相對較低，加上大分子量蛋白的轉移不完全，可能是我沒有拿到大分子量條帶結果的原因。另外背景稍微有一些臟(背景整體均勻一致)，估計是二抗的濃度高了些，準備降至1:5000，另外抗體稀釋液準備改用5%奶粉TTBS，封閉改為室溫2小時。這個過程有沒有問題？
解答：首先分析你的整個實驗步驟。我發現了兩個比較大的毛病：
1、一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。
2、“biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘”，你是這么做的嗎？因為我大部分時間是做的恒流轉移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd轉2小時。到最后電壓會升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉上去。我建議你最好能將時間延長，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當延長時間。有時候你的marker也有可能欺騙你，因為marker的量比較大，是很容易轉上去的，實際上目標蛋白的量遠遠少于marker量。
我對你的結果分析如下：
1、你的結果很好，估計離目標不遠了，很快就可以成功。
2、 沒有160kd的帶是因為你的轉移時間過短，適當延長轉移時間（我懷疑這是主要的問題）。
3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景會低一點。

10. 方法的介紹

XXX. 我想將hbx轉到hepg2 細胞里 通過檢測hbx蛋白的水平來 檢驗轉染的效率 不知道可不可行？
解答：Western Blot檢測HBX蛋白的表達來檢測轉染效率不是一個好辦法，建議還是：
1、最好是帶有熒光標簽的HBX轉染來看轉染效率，最可靠
2、其次，HBX和熒光載體共轉染，相對說明問題
3、熒光載體單獨轉染，主要是看細胞好不好轉了呵呵
轉染效率高低熒光顯微鏡下一目了然了。有的細胞熒光強，有的細胞熒光弱，有的沒有。所以HBX表達強很可能是少數細胞熒光強的結果，不代表轉染效率。