蛋白純化常見問題總結（一）

蛋白純化過程中常遇見一些問題，這里整理了以下幾個蛋白純化實驗中遇見的問題及其解決方案。

1)我現在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發現目的蛋白沒有活性。

請問有哪些可能會出現這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。

既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。

2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?

親和的填料合成過20來種，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯，何況它們幾乎是同一個輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當然FMN的結構上也有個仲胺，可以偶聯到帶長手臂的環氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質都不大好，因此我覺得這個沒有什么問題。   

此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠，因為它的配基的結構和FMN的三個環很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。

相應的偶聯的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質，自己偶聯就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基最好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質為好，此外也曾經有文獻報導固定輔酶時，偶聯位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質。

不同的活化的介質對偶聯的配基有不同的要求，所以要先對自己的配基有一個清楚的了解就可以選擇合適的活化介質。

我一般在合成的時候大多選擇環氧瓊脂糖凝膠，它能應用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應基團。此外鍵合的鍵很穩定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。

包涵體的蛋白復性做得不多，但是我記得有個哥們說最管用的辦法也是最簡單的方法，他說在復性的時候盡量別想什么太高難的技術，那些時髦但不一定好用，常用的有透析復性，稀釋復性，包括國外的專家也這么說。我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行，關鍵要經常改變條件。

層析復性很時髦，但是真正能用的不是很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關鍵要多看文獻，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。