蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十三）
圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響 洗脫液：加入如圖所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為15分鐘。樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑。 如圖18所示，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM，pH為2~2.5。此外，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質的分離效果要優于TFA。盡管同TFA一樣，磷酸鹽緩沖液使用的pH通常較低，但磷酸鹽緩沖液也能適應較高的pH，為選擇性和分辨率的改變提供了機會（見17頁）。將磷酸鹽作為離子對試劑的主要弊端是：磷酸鹽不揮發，很難從肽中去除。 一些時候，七氟丁酸用作組蛋白等堿性蛋白分離的離子對試劑 圖18. 使用除TFA以外的離子對試劑可能會產生不同的選擇性 條件色譜......閱讀全文
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十三）
?圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響 洗脫液：加入如圖所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為15分鐘。樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（H
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十七）
選擇分離表面。硅膠表面改性所用的化學過程允許多種有機基團附著在硅膠表面。最常見的改性是鍵合一條十八碳線性脂肪鏈，形成“C18”柱或ODS柱（圖10A）。如圖所示，有機氯硅烷與大多數硅烷醇基反應，但仍有部分不反應，這會在硅膠表面形成一層較厚的碳氫化合物層。蛋白質和多肽可以吸附到該碳氫化合物層。C18柱
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十五）
其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑。 如圖18所示，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM，pH為2~2.5。此外，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質的分離效果要優于TFA。
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十四）
蛋白質/多肽液相分析中的流動相選擇有機溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當有機溶劑量達到針對每一蛋白質的特定濃度時，蛋白質就會從疏水界面上解吸，繼續順著柱向下，從而從柱中洗脫。 圖14. 當有機改性劑的濃度達到特定值時，蛋白質從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時最
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十八）
引言反相HPLC已成為分離和分析蛋白質和多肽的重要工具。它在生物技術行業中被廣泛應用于蛋白質類治療產品的表征，以及這些產品和雜質的鑒定。在通過質譜鑒定蛋白質之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質組中分離多肽方面有著至關重要的作用。它也被用于探索性研究中多種蛋白質和多肽的純化，以及蛋白類治療藥物的大規模
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（六）
蛋白質在高溫或高pH值下會降解。在脅迫條件下，最有可能發生的化學降解是酰胺側鏈上的天冬酰胺轉變為天冬氨酸或異天冬氨酸（圖37)。天冬酰胺脫去酰氨基時，許多蛋白都會失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。特定天冬酰胺殘基
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（七）
在氧化環境條件下，盡管蛋白質的幾個氨基酸都可能受影響，但最有可能被氧化的氨基酸是甲硫氨酸；甲硫氨酸可被氧化成甲硫氨酸亞砜（圖34）。對甲硫氨酸殘基的氧化取決于其在蛋白質中的位置。埋藏在蛋白質內部的甲硫氨酸不可能被氧化。接近表面且與溶劑接觸的甲硫氨酸側鏈最有可能被氧化。氧化條件包括熱、過渡金屬的存在以
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（八）
肽圖分析法 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南反相高效液相色譜已成為蛋白質分析和表征的標準方法，尤其是治療性藥物的分析和表征。反相色譜分析法分辨率高，檢測靈敏度好，能夠提供大量關于蛋白質的信息。有些時候，蛋白質作為完整的分子分析，但更多的時候采用蛋白水解酶作用于特殊的氨基酸殘基將碳骨架斷開，
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（九）
胰蛋白酶水解分析。蛋白質水解產生的肽段利用反相高效液相色譜分析，流動相采用含TFA體系（參見第15-17頁），以起始濃度約5%的乙腈梯度洗脫（乙腈起始濃度低于5%可能導致較早洗脫出肽的色譜的不可重現性），乙腈濃度逐漸升至70%（參見圖31）。梯度洗脫的時間取決于待水解蛋白的大小。大分子蛋白比小分子蛋
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十）
反相高效液相色譜和質譜（MS）的聯用為蛋白質/多肽分析提供了強大的工具。20世紀80年代，約翰·貝內特·芬恩和他的同事們開發了電噴霧離子源，使質譜與反相高效液相色譜得以聯用。采用液相色譜-質譜聯用的好處包括：質譜是非常靈敏的檢測技術。 質譜可以提供所分離多肽/蛋白質的分子量。 質譜可利用分子
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十一）
HPLC-MS 聯用的兩個重要因素是電噴射接口的最佳流速及三氟乙酸對肽電離的影響 基本電噴霧接口的信號在5~10μL/min的流速區間上迅速下降（圖28）。這與采用標準分析型HPLC柱的流速不相容。目前，商用電噴霧提供一種高剪切流氮氣輔助的電噴霧（氣流輔助電噴霧），它將電噴霧的最佳流速區間提升到了2
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十六）
選擇合適的色譜柱微粒。通過與柱內填充微粒疏水表面的相互作用實現蛋白質與多肽的分離。柱內填充粒通常以硅膠為基礎，這是因為硅膠的穩定性高，能夠在大多數溶劑條件下（除了pH大于6.5的情況）保持穩定，此外，硅膠可以形成各種大小的具有不同直徑的多孔球形顆粒。硅膠純度。高效液相色譜柱所用硅膠填料的純度對分離性
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（十二）
蛋白質/多肽液相分析中的流動相選擇有機溶劑可將吸附在疏水界面的蛋白質洗脫（圖14）。在梯度洗脫期間，當有機溶劑量達到針對每一蛋白質的特定濃度時，蛋白質就會從疏水界面上解吸，繼續順著柱向下，從而從柱中洗脫。圖14. 當有機改性劑的濃度達到特定值時，蛋白質從疏水界面洗脫。乙腈。在多肽的反相色譜分離時最常
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（五）
二硫鍵測定蛋白質依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級結構和生物活性。如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質會失去天然三級結構和生物活性。HPLC保留值取決于蛋白質“疏水腳”的大小（圖41），它會受到三級結構的影響。二硫鍵的改變通常會使“疏水腳”增大，從而使蛋白質在反相HPLC中的保留值增大。圖42中，天然白細胞
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（一）
蛋白質組學蛋白質組學是鑒定和定量細胞、組織或生物體蛋白質的科學，目的是了解生物學變化和疾病狀態，開發疾病的生物標記和治療藥物的靶點。如果將一個基礎蛋白的各個修飾蛋白算作一個蛋白，那么哺乳動物細胞含多達3~4萬個蛋白。當計算各個修飾后的蛋白時，蛋白質的數量遠遠超過了10萬。細胞內不同蛋白質的豐度或濃度
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（四）
柱內徑由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內徑小于2mm）。小規模實驗室純化采用細孔柱（內徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內徑）。這種小規模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。需要大量蛋白質/多肽時，采用10mm和22mm內徑的柱子。1 mg蛋白質或多肽的純化可采用10 mm柱子
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（二）
色譜分析色譜技術已發展成一種強大的分離技術，能夠分離大量蛋白質和多肽。但任何一種單獨的色譜技術仍然只能分離出一小段蛋白質。因此，多種色譜技術的結合使用已成為蛋白質組分析中蛋白質分離的一種普遍方法。二維色譜在長期的蛋白質純化模式的基礎上，John Yates和同事開發了一種名為多維蛋白質鑒定技術（Mu
蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南（三）
蛋白質純化RP-HPLC 是一種有效的蛋白質/多肽純化工具。通過 RP-HPLC 法可以從雜質中分離目標蛋白/多肽，采集到的片段可用于進一步研究，以及借助正交分析技術的分析，甚至可作為治療藥物。在蛋白質/多肽分析過程中，色譜條件優化的目標是優化分辨率和保留時間。制備色譜法分離蛋白質/多肽時，色譜條件
反相高效液相層析實驗_多肽和蛋白質的分離
實驗材料蛋白質試劑、試劑盒TFA乙腈鹽酸胍儀器、耗材層析柱HPLC進樣器實驗步驟1. ?用經脫氣的HPLC級水洗去反相柱的有機溶劑，梯度從100%有機溶劑到100%水，流速1 ml/min，持續15 min 以上。?2. ?以100%的TFA/乙腈緩沖液平衡柱子至柱壓和光吸收值達到恒定。用10~15
經驗：反相HPLC柱子的清潔和再生
反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用最廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數的非極性物質和很多的可離子化的離子化合物。大多數用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的物質也能以同樣的保留方式分離。圖片來源于網絡 固定相上還有
蛋白質和多肽MALDIMS分析方法
ABSTRACTFor MALDI-TOF-MS analysis of proteins and peptides, samples are cocrystallized with an excess of organic matrix that absorbs at a specific wav
多肽和蛋白質類藥物的分析方法
1.1 生物檢定法由于蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決于藥物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類藥物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中藥物濃度及鑒定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。1.1.1 在體分析 常規的
多肽和蛋白質類藥物的分析方法
1.1 生物檢定法由于蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決于藥物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類藥物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中藥物濃度及鑒定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。1.1.1 在體分析 常規的
多肽和蛋白質類藥物的分析方法
1.1 生物檢定法由于蛋白多肽類藥物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決于藥物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類藥物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中藥物濃度及鑒定標記藥物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。1.1.1 在體分析 常規的
多肽和蛋白質的區別
一方面是多肽中氨基酸殘基數較蛋白質少，一般少于50個，而蛋白質大多由100個以上氨基酸殘基組成，但它們之間在數量上也沒有嚴格的分界線，除分子量外，還認為多肽一般沒有嚴密并相對穩定的空間結構，即其空間結構比較易變具有可塑性，而蛋白質分子則具有相對嚴密、比較穩定的空間結構，這也是蛋白質發揮生理功能的基礎
蛋白質和多肽的區別
分子量：蛋白質的分子量通常大于多肽。蛋白質是由多個多肽鏈通過肽鍵連接而成的大分子，而多肽通常由少于50個氨基酸組成。 結構：蛋白質具有三維空間結構，包括一級結構（氨基酸序列）、二級結構（α-螺旋和β-折疊）、三級結構（整個蛋白質的三維形狀）和四級結構（多個蛋白質亞基的組合）。多肽通常沒有這些復
多肽和蛋白質的區別
多肽和蛋白質的區別，一方面是多肽中氨基酸殘基數較蛋白質少，一般少于50個，而蛋白質大多由100個以上氨基酸殘基組成，但它們之間在數量上也沒有嚴格的分界線，除分子量外，還認為多肽一般沒有嚴密并相對穩定的空間結構，即其空間結構比較易變具有可塑性，而蛋白質分子則具有相對嚴密、比較穩定的空間結構，這也是蛋白
蛋白質提取和純化
蛋白質提取和純化（主要內容如下）Protein Extraction?Protein PurificationProtein PrecipitationColumn PreparatioinQ & A Posted in the Method ForumProtein ExtractionWhole
多肽和蛋白質的區別簡介
多肽和蛋白質的區別，一方面是多肽中氨基酸殘基數較蛋白質少，一般少于50個，而蛋白質大多由100個以上氨基酸殘基組成，但它們之間在數量上也沒有嚴格的分界線，除分子量外，還認為多肽一般沒有嚴密并相對穩定的空間結構，即其空間結構比較易變具有可塑性，而蛋白質分子則具有相對嚴密、比較穩定的空間結構，這也是
蛋白質、多肽液相色譜純化方法
?? 1、純化的一般目標和方法 首先，自然來源或者重組表達的蛋白質經過一些粗提的步驟（例如：勻漿、離心、硫酸銨沉淀等）成為穩定的可以用于色譜分離的樣品。 然后進行捕獲色譜（capturechromatography），主要目標是濃縮和去除大量的容易去除的雜質，此步最關心的是流速和載量，常采用高載