分子克隆蛋白表達實驗指南（十）
13．連接產物轉化DH5α（預開42C水浴） 與T載體轉化相同，先轉化DH5α，篩選及擴增目的重組質粒 轉化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目： 1． 目的基因引物PCR驗證 2． 表達載體引物PCR驗證 3． Step2中PCR產物膠回收后，以膠回收為模板、基因引物進行nest PCR 4． 小抽雙酶切驗證 驗證后再小量抽提質粒，保存50ul質粒及相應的DH5α細菌 小抽重組質粒轉化表達菌BL21。轉化BL21后只需基因引物PCR驗證 目的基因表達 14．快速誘導表達 ......閱讀全文
分子克隆蛋白表達實驗指南（十）
13．連接產物轉化DH5α（預開42C水浴）?????? 與T載體轉化相同，先轉化DH5α，篩選及擴增目的重組質粒?????? 轉化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目：? 1．? 目的基因引物PCR驗證? 2．? 表達載體引物PCR驗證? 3．? Step2中PCR產物膠回收后，以膠回收為模板、
分子克隆蛋白表達實驗指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the ? absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 ? 0.5
分子克隆蛋白表達實驗指南（四）
7. PCR產物與TA載體連接?? pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation ? efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.? +A s
分子克隆蛋白表達實驗指南（六）
10. 測序? 突變后氨基酸序列沒有變化仍可用于表達。測序報告中blast時若有‘－’符號，則人工對照測序圖譜。? 測序驗證后沒有突變或者同義突變的重組質粒必須小抽，50ul，conc300ug/ml備份。測序文件應妥善保存，蛋白表達完成后一并提交存檔。? 獲得GS后，即可構建含GE的重組T載體，用
分子克隆蛋白表達實驗指南（十一）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MarkerUII 37CUI’I’??????? Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul??????? UI：未誘導菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個??????? I：誘導后對照，上樣10ul??????? UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表達實驗指南（十九）
Desired? pH? Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL)????????????? 5.8? 8.591.5????????????? 6.0? 13.286.8????????????? 6.2? 19.280.8?????????
分子克隆蛋白表達實驗指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions:????? 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH?? Buffer B (200ml
分子克隆蛋白表達實驗指南（七）
目的基因表達?? ?? 14．快速誘導表達? 快速誘導目的是為檢測該重組質粒在BL21中是否能被誘導表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導效率的差異。? 5．? 挑單克隆菌落于7ml含有相應抗生素LB培養液的50ml培養管中，37C振蕩培養過夜（8-16h）。? 6．? 37C，1mM ?
分子克隆蛋白表達實驗指南（一）
目的基因克隆包括保存用全長基因(gene for saving, GS)和表達用全長基因(gene for expression, GE)兩部分。? 這兩部分所克隆的基因都是全長片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精確克隆(及引物從基因CDS兩端開始)很難找到高效價的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆蛋白表達實驗指南（十六）
Amp(50mg/ml)??????? 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養基，1:1000比例稀釋?????? ????? Kan(50mg/ml)??????? 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表達實驗指南（五）
8. TA質粒轉化菌落的驗證? 與表達載體的驗證不同，轉化TA質粒時不用雙酶切驗證。只需用目的基因引物和TA載體引物PCR驗證即可。TA載體引物PCR片段比插入片段大約長150bp。? 目的基因退火溫度與之前膠回收時溫度相同，TA退火溫度60C即可，但可在55～70之間變動，不會影響結果。? 挑取至
分子克隆蛋白表達實驗指南（十三）
7．? ? 電泳結束后，按比例從膠上割下相應約1cm條帶（當按比例的條帶割下后可相應的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。? 8．? 將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。? 9．? 移出放電透析tube的架子，
分子克隆蛋白表達實驗指南（九）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4?????????? M：marker；上樣10ul? UI：未誘導對照；10ul? BS：超聲前樣品；10ul? S：超聲后上清； 10ul? P：超聲后沉淀； 10ul? T：誘導后每隔1h樣品，1
分子克隆蛋白表達實驗指南（十四）
RbCl制備感受態細胞? 需準備的滅菌器具和培養液：? SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml ? EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰? 離心管，EP管，移液管使用前均需要放
分子克隆蛋白表達實驗指南（二）
取DEPC水時切記帶上手套?? ? Genequant使用方法：? 開機－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否為320nm)－set-ref(此時插入空白對照)－樣品? 1．使用前將比色皿中水吸出，用1ml蒸餾水重新洗滌再將比色皿中的水吸盡（先用1ml槍吸，后用100ul槍吸）
分子克隆蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
分子克隆蛋白表達實驗指南（八）
15. 小量蛋白誘導表達????? 該步驟的目的是檢測蛋白是否在上清存在表達。低溫時蛋白易于表達于上清，因此小量蛋白誘導表達以20或30C為培養溫度。? 1. 挑一單克隆的菌落于5ml含有相應的抗生素的LB培養液中，37℃振蕩培養過夜（8-16h）。? 2. ? 過夜培養液加入三瓶50ml含
分子克隆實驗指南第四版發售
在生命科學領域，沒有一本書比它更紅，幾乎每個實驗室都有，幾乎每個人都翻過。它就是《分子克隆實驗指南》。30年前，這本書誕生于冷泉港實驗室出版社，它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆講習班實驗方案的匯編。7年后，該書又出了第二版。當時的人們也許未曾料到，這部著作在20年的時間里竟成為指導生命
有關融合蛋白表達載體的克隆
在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase
表達蛋白檢測實驗
實驗方法原理 當重組病毒通過噬斑純化和擴增后，免疫印跡可用于鑒定重組蛋白，并檢測其是否有預期的大小以及是否從感染細胞中分泌。下面的步驟是介紹檢測非分泌性（細胞內）蛋白的，如果重組蛋白是分泌到培養基中的，可按注解中的步驟操作。實驗材料 生長至匯片的單層 BS-C-1 細胞重組痘苗病毒儲液試劑、試劑盒
表達蛋白檢測實驗
免疫印跡法 免疫沉淀法 點印跡法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 當重組病毒通過噬斑純化和擴增后，免疫印跡可用于鑒定重組蛋白，并檢測其是否有預期的大小以及是
分子克隆實驗載體DNA的選擇
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
試劑、試劑盒?瓊脂糖凝膠蒸餾水 DNA 點樣染料甘油蒸餾水 溴酚藍 二甲苯腈 FF溴化乙錠溶液任意引物（H-AP)cDNAdNTP 混合液未標記的錨定引物載體特異性引物PCR 緩沖液Tris-HClKClMgCl2明膠 TaqDNA 聚合酶儀器、耗材?電泳裝置離心管熱循環儀薄壁 PCR 管UV 透射
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 瓊脂糖凝膠 蒸餾水 DNA 點樣染料 甘油 蒸餾水 溴酚藍 ? 二甲苯腈 FF 溴化乙錠
差異表達－cDNA－的重新擴增、克隆與測序實驗
從丙烯酰胺凝膠上切下潛在的差異表達 cDNA 之后，用同一種錨定-任意引物組合重新擴增 cDNA, 反應條件與最初 PCR 相同。重新擴增的產物，可以進行克隆和測序，以供進一步分析。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒瓊脂糖凝膠蒸餾水DNA 點樣染料甘油蒸餾水溴
克隆技術（十）
克隆多利羊1996年7月5日克隆出一只基因結構與供體完全相同的小羊“多利”（Dolly），世界輿論為之嘩然。“多利”的特別之處在于它的生命的誕生沒有精子的參與。研究人員先將一個綿羊卵細胞中的遺傳物質吸出去，使其變成空殼，然后從一只6歲的母羊身上取出一個乳腺細胞，將其中的遺傳物質注入卵細胞空殼中。這克
分子克隆介紹
各位小伙伴，大家還記得當初進實驗室的時候接觸到的一個實驗技能是什么呢？沒錯，是 PCR 擴增。小編曾經也是，看著自己親自配比 PCR 克隆擴增的每個組分，親眼看著瓊脂糖凝膠在紫外透光臺上發出的幽綠色的熒光，也是深深被迷住。但總不可能成天就對著這個邪魅的熒光發呆，對吧？看久了，她會愛上你的眼
蛋白質的短暫表達實驗
實驗材料載體試劑、試劑盒牛血清DMEM葡聚糖PBSDMSOEDTA儀器、耗材培養皿培養箱相差顯微鏡離心機實驗步驟1. ?將目的基因亞克隆至合適的載體中得到所需的重組DNA，用小量法（5 ml 培養物）或用CsCl/溴化乙錠離心法純化重組DNA。2. ?將在DMEM-10 CS中生長匯片的COS-7細