材料：
無菌
生長液:
胰蛋白酶（0.25% + EDTA ，1 mmol/L ，溶于 PBSA 中）
MTT : 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二甲苯基溴化四唑，50 mg/m l, 濾過, 除菌。
Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1 mol/L 甘氨酸，0.1 mol/L, NaC l，用 1 mol/L Na(OH) 將 pH 調至 10.5)
微滴定板（Iwaki)
微量吸頭，最好放在高壓滅菌的吸頭盒中
5 cm 和 9 cm 培養皿（未經 T C 處理的）或儲液器（Corning)
30 ml 和 100 ml 通用容器或試管
非滅菌
塑料盒（無毒的聚苯乙烯，裝培養板用）
多道加樣器
二甲基亞砜 (DMSO) DMS( ) 分裝器:Labsystems Microplate Dispenser (Cat No 5840127，Thermo Electron)
ELISA 讀板儀（Molecular Devices，with SOFT max PRO ; 見附錄Ⅱ )
離心用的板架（用于懸浮生長的細胞）
操作步驟
接種細胞
1. 用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞收集到含血清的培養基中。
2. 離心細胞懸液（5 min ，200 g )，使細胞沉積下來。用培養基重懸細胞，計數。
3. 將細胞稀釋至 2.5 X103~50 X103 個/ml，這要依細胞系的生長速度而定，每個微滴定板可以容納 20 ml 細胞懸 液。
4. 將細胞懸液移至 9 cm 培養皿中，用多道加樣器在平底 96 孔板中間 10 列的各孔中加人 20 ul 細胞懸液（每板 80 孔），從第 2 列開始到第 11 列為止，每孔加入 0.5X 103~10X 103 個細胞
5. 將 200ul 培養基加至第 1 列與第 12 列的 8 個孔中。第 1 列用作讀板儀的空白對照，第 12 列有助于維持第 11 列的濕 度，并將「邊緣效應」（edge effect) 減至最小。
6. 將培養板放至塑料飯盒中，于 37℃：濕潤環境中溫育 1~3 d ，等細胞進入指數生長期時可加入藥物。
7. 對于非黏附細胞，用新鮮培養基制備細胞懸液，將細胞稀釋至每毫升 5X 103~100X 103 個/m l，僅取 100 ul 細胞 懸液接種于圓底 96 孔板，之后立即加入藥物。
添加藥物
8. 用培養基將細胞毒性藥物 5 倍系列稀釋，共制備 8 個濃度。選擇濃度時應以最高濃度下多數細胞被殺死，而最低 濃度時不會殺死細胞為標準。只要對藥物的毒性有所了解，便可采用較小的濃度范圍。一般情況下，每種藥物使 用 3 塊培養板，這樣一次試驗中可以有三個平行測定結果。
9. 對于貼壁生長的細胞，去除第 2-11 列各孔中的培養基，這可以通過將皮下注射器針連在吸引管上完成。
10. 在第 2 列和第 11 列的 8 個孔中加人 200^1 新鮮配制的培養基，這些細胞作為對照。
11. 在第 3~10 列的細胞中加入細胞毒性藥物。每個藥物濃度僅需 4 個孔，這樣 A-D 行可用于第一種藥物，E ~H 行用于第二種藥物。
12. 將藥物溶液移至 5 cm 培養皿中，用 4 道加樣器向每組的 4 個孔中各加入 200 ul。
13. 將培養板放回塑料盒中，溫育至確定的暴露時間。對于非黏附細胞，將藥 物稀釋至預期終濃度的 2 倍，取 100^1 加入已含 100^1 細胞的孔中。
生長期
14. 在藥物暴露期結束時，去除所有含有細胞的孔中的培養基，加入 200 ul 新鮮的培養基。若是非黏附細胞，離心培 養板（5 min ，200 g )，使細胞沉淀下來。然后用細針頭吸去培養基，不要擾動細胞團。
15. 每日換液至 2~3 個 P D T 。
存活細胞數的估算
16 . 在生長期末，每孔中各加人 200 ul 新鮮的培養基，在第 1-11 列所有孔中各加人 50 ul MTT 。
17. 以鋁箔包裹培養板，于 37℃濕潤環境中溫育 4 h 。請注意 4 h 是所需的最短溫育時間，可延至 8 h 。
18.. 棄去孔中的培養基和 (非黏附細胞則離心），在第 1-11 列所有孔中各加入 200ul DMSO , 以溶解殘留的 MTT - 甲臘結晶。
19. 在含 DMSO 的各孔中加人甘氨酸緩沖液（每孔 25 ul )。
20. 立即在 570 nm 處記錄吸光值，因為產物不穩定。讀板儀用第 1 列中含培養基和 MTT 但不含細胞的各孔調零。
MTT 試驗分析
21. 以藥物濃度為橫坐標（X 軸），吸光值為縱坐標（Y 軸）繪制曲線圖。
22. 第 2 列和第 11 列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值，對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為 IC50 濃 度。偶爾結果并非如此，這表明整個板中所接種的細胞數不一致之故。
23. 得到吸光值的絕對值，以此作圖，這樣才能與對照吸光值比較，然后要將數據轉化成百分率抑制曲線 (圖 22.6)， 從而使一系列曲線標準化。
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