蛋白樣品制備方法學評估

蛋白質樣品的制備，是蛋白質研究的第一步，不論后續采用何種分離或鑒定手段，樣品制備都是重要步驟。

蛋白質樣品制備的意義

生物的蛋白質種類多達 10 萬種以上，樣品中的蛋白質種類也可達到1萬種以上，但大部分蛋白質的拷貝數很少，因此通過樣品制備起到濃縮蛋白質的作用。

去除樣品中各種非蛋白質的影響。

如何進行蛋白質的制備

蛋白樣品制備包括蛋白質的分離，提取和純化。從各類研究角度而言，樣品制備都要盡可能獲得所有樣品中的蛋白質，但是由于蛋白質種類多，豐度不一，物化特性多樣等因素，要到達真正的完全蛋白質制備是非常困難的。

在制備中丟失的蛋白是永遠不可能在后面試驗中彌補回來的！

樣品制備的原則:

盡可能采用簡單的方法進行樣品的制備。

盡可能提高樣品的溶解度，使所有待分析的蛋白質樣品全部處于溶解狀態，且穩定可重復。

盡可能減少蛋白的降解。

根據下游實驗選擇決定提取蛋白的方法，例如提取變性還是活性蛋白，提取總蛋白還是亞細胞結構組分蛋白。

盡量去除干擾下游應用的雜質，包括但不僅限于核酸，組織碎片，或某些高豐度無關蛋白。

樣品制備的基本流程：

樣品的破碎

樣品的裂解

雜質的去除及蛋白質溶液的獲取

樣品的破碎

為了完全分析細胞內蛋白，樣品必須經過有效的破碎，破碎方法的選擇依賴于樣品來源不同（如組織，固定組織，難研磨組織，脂肪，菌體）而不同，同時也依賴于提取蛋白的類型（如是獲取總蛋白還是特殊的亞細胞結構組分）。

通常組織樣品和微生物樣品都需要進行破碎處理，而細胞樣品不需要。破碎可以通過滲透，凍融，酶解，超聲，高壓，液氮研磨，機械勻漿，玻璃珠勻漿等方式完成。選擇破碎方式時也要考慮使用的裂解液配方是否可以wan美的配合，以得到蕞佳的提取效果。提取總蛋白時需要盡量的破碎樣品釋放蛋白，而特殊的亞細胞結構分離則需要根據提取方法采用合適的破碎方式。

提示：內源性的蛋白酶通常存在于細胞質內，在細胞破碎時可能會釋放出來，導致某些蛋白質的降解，從而影響下游實驗結果，因此可在細胞裂解前添加蛋白酶抑制劑加以保護。

樣品的裂解

樣品裂解是指對蛋白質進行增溶性溶解的過程，可通過破壞蛋白質與蛋白質，蛋白質與非蛋白質之間的相互作用完成。通常裂解液中會添加表面活性劑，不同的裂解液配方所能溶解和獲取的蛋白種類和得率會有較大差別，所得到的蛋白譜也會不同，所以看似簡單的樣品裂解卻是決定整個實驗成敗的關鍵點。優質的裂解液配方既能實現蛋白質間的良好分離，又不影響下游實驗。

去除雜質和蛋白質獲取

蛋白樣品中的雜質主要包括核酸，脂類，組織碎片等，這些雜質均會干擾下游實驗。特別是核酸雜質會增加樣品的粘度，可能會引起下游實驗中凝膠孔堵塞，核酸與蛋白結合阻礙聚集，銀染或 WB 背景過高等問題，所以需盡量去除雜質。去除雜質后即可獲得蛋白質溶液。傳統的提取方法（如RIPA裂解液和溶液法提取的試劑盒）缺少有效的雜質去除步驟，通過離心取上清的方式獲取的蛋白質無法完全去除雜質，且獲得的蛋白純度較低，同時也會損失較多蛋白質，從而影響蛋白的提取質量，改變樣品中真實的蛋白譜。

亞細胞結構分離

大部分實驗通常可以用總蛋白組分進行蛋白質的分析，但是涉及到某些低豐度蛋白或者蛋白細胞定位和蛋白轉運研究時，則需要進行樣品的亞細胞結構分離，也就是將樣品中的蛋白分成幾個組分，分別進行蛋白質的研究。根據蛋白質在細胞中不同的細胞定位進行分離，可分離細胞核，細胞膜，內質網，線粒體，高爾基體，溶酶體，內體等結構。亞細胞結構分離不僅可以提高低豐度蛋白質的上樣量，降低檢測難度，還可以針對某一細胞組分的蛋白質進行分析。

傳統的亞細胞結構分離主要是將樣品勻漿后，進行密度梯度離心分離不同組分，傳統提取方法操作步驟多而復雜，所需起始原料量極大，需使用超高速離心及配制密度梯度溶液，得率較低，失敗率高，使得下游實驗困難增加，阻礙深入研究進程。為了加速科研者在蛋白領域深入研究的腳步，Invent 打造了柱式法亞細胞結構分離平臺，配有全套的動植物亞細胞結構分離工具，可分離內質網，高爾基體，溶酶體，線粒體，內體，細胞膜，葉綠體，外泌體，微粒體，細胞核等，僅需極少的樣品，無需超高速離心，即可獲得高質量的亞細胞結構。