單抗藥和Remdesivir組合是治療新冠肺炎的救星嗎？

　　截止至2020年2月10日17時，2019-nCoV所致的肺炎死亡率為2.3%左右。可以預見，進一步研究2019-nCoV病毒感染致病機制，進而針對性開發有效藥物，最終降低新型冠狀病毒肺炎的死亡率，將是今后新冠肺炎防治工作和相關科學研究的重要組成部分。

　　但問題是：

　　● 治療新型冠狀病毒肺炎未來藥物可能會有哪些？

　　● 可以直接用恢復期病人體內的抗體開發單抗藥嗎？

　　● 哪些靶點可能會成為未來抗2019-nCoV病毒特異性藥物靶點？

　　● 靶向炎癥因子（或受體）的單抗藥/拮抗劑的免疫調節療法會有效嗎？

　　本文結合多篇文獻及最新研究進展對上述問題進行闡述，閱讀時間約5-10分鐘，歡迎回復討論。

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　　導 讀

　　Remdesivir和單抗藥組合被認為可能是理想的2019-nCoV肺炎治療方法，未來研發抗2019-nCoV病毒的特異性治療藥物（如單抗藥）和有效減輕肺部病變癥狀的藥物是治療新冠肺炎一個重要方向。

　　基于2019-nCoV病毒的基因組與SARS-CoV相似度較高，進入細胞模式可能都利用Spike蛋白和宿主受體ACE2結合，由相同的宿主蛋白酶TMPRSS2、Cathepsin B/L來切割Spike蛋白介導進入宿主細胞，ACE2、TMPRSS2和Cathepsin B/L顯示出作為抗2019-nCoV病毒藥物靶點的潛在價值。另外，科學家發現新冠肺炎患者血漿Th1細胞反應激活（IL1B、IFNγ、IP10和MCP1上調），Th2炎癥因子IL4和IL10也上調，明確新冠肺炎肺病變的病理生理機制對研發/應用減輕肺部病變癥狀藥物非常關鍵。

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　　治療新型冠狀病毒肺炎未來藥物可能會有哪些？

　　針對2019-nCoV的藥物開發，Hongzhou Lu總結出方法主要有三類：1.測試現有的廣譜抗病毒藥物，如I型、II型干擾素；2. 篩選小分子化學藥庫；3. 基于基因組和生物物理學信息重新開發特異針對新型冠狀病毒的藥物，包括siRNA和特異性病毒抑制劑等。潛在的有效藥物包括 1 ：Lopinavir/Litonavir（抑制和2019-nCoV同樣屬于RNA病毒的HIV-1，2的蛋白酶），核苷類似物（如Fabiravir和Ribavirin，抑制病毒核苷酸生物合成），神經氨酸酶抑制劑（如Oseltamivir、Zanamivir和peramivir），融合肽（如EK1），Abidol，RNA合成抑制劑（如TDF、3TC），抗炎藥（如激素和其他化合物），部分中藥制劑以及最近備受關注的Remdesivir（瑞德西韋，在研的廣譜抗病毒藥，核苷酸類似物，抑制RNA合成酶）。

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　　備受關注和期待的瑞德西韋

　　瑞德西韋（Remdesivir）是吉利德（Gilead）科學公司開發的一種廣譜的抗病毒核苷類似物，在體外實驗已顯示出抗RNA病毒活性，如Ebola（埃博拉病毒）、Marburg（馬爾堡病毒）、RSV（呼吸道合胞體病毒）、NiV（尼帕病毒）、Hendra（亨德拉病毒） 2-4 。

　　Remdesivir 在稍早2020年1月10日被報道在細胞和小鼠模型中具有抗MERS-CoV（中東呼吸綜合癥冠狀病毒）、改善肺功能、減少病毒載量以及減少肺部病變的功能 5。Manli Wang等報道在Vero E6細胞模型中，Remdesivir顯示出了抑制2019-nCoV病毒感染的效果，半數有效濃度EC50為0.77μM，選擇指數SI大于129.87 6，然而其安全性和有效性還未被證實，且尚未在任何國家獲批上市。鑒于2019-nCoV和MERS-CoV同屬冠狀病毒 7,8，且結構類似，其抗2019-nCoV潛力巨大。Michelle L. Holshue等報道在對新冠肺炎發病第7天的1例患者同情性地給予在研藥Remdesivir 治療1天后，患者癥狀明顯改善，并最終痊愈 9。2020年2月3日，Remdesivir治療2019-nCoV的臨床試驗在北京中日友好醫院啟動，其臨床實驗結果預計在幾個星期內對外公布。

　　結合近期Regeneron公司開發抗MERS病毒單克隆抗體的進展，Vanderbilt大學醫學中心Mark Denison認為理想的2019-nCoV肺炎治療方法可能是Remdesivir和抗病毒特異性單抗藥物的組合給藥。抗病毒特異性單抗藥可以設計為阻斷病毒特異性感染細胞過程中關鍵的宿主/病毒蛋白，阻止病毒感染宿主細胞，或是靶向病毒的關鍵蛋白而使其失活，故可選擇開發靶向性更好的單抗藥治療2019-nCoV肺炎。

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　　可以直接用恢復期病人體內的抗體開發單抗藥嗎？

　　的確，利用恢復期病人的抗體來開發抗病毒單抗藥是一個很有吸引力的設想。人們陸續發現在臨床上，用恢復期病人的血漿去治療SARS-CoV 10、1918和2009 H1N1、H5N1流感病毒 11-13感染的患者產生了良好的效果，尤其在疾病癥狀初起時應用效果更好 14，目前還沒有報道用2019-nCoV所致肺炎患者的血漿去測試抗2019-nCoV病毒效果，值得注意的是，馬來源的抗SARS-CoV血清在體外1:80稀釋顯示出較強的中和2019-nCoV病毒效果 8。

　　但是恢復期病人血漿較難獲得，且中和抗體的滴度較低，會阻礙該方法在臨床上的應用 15 。因此，分離病毒感染的病人或接種疫苗的個體漿細胞或記憶B細胞篩選重組生產中和抗體即是一個可替代的方案 15。

　　那么利用恢復期病人的抗體來開發抗病毒單抗藥設想的實現流程可以是：

　　1. 分離恢復期病人的外周血單個核細胞；

　　2. 流式分選可以與抗原結合的陽性B細胞，并以一孔一個細胞的密度把B細胞種在微孔板內；

　　3. 反轉錄B細胞的RNA為cDNA后，設計針對人源IgG的引物，對其輕重鏈的高變區進行PCR和測序，構建在抗體表達載體上；

　　4. 在細胞模型中進行單克隆抗體輕重鏈配對，篩選配對成功的單克隆抗體；

　　5. 進一步用單克隆抗體進行病毒中和檢測，篩選最佳克隆作為單抗藥候選。

　　此外，利用實驗動物，如小鼠、兔子和豚鼠等的抗體做嵌合化的人源抗體技術已日趨成熟，即將抗原免疫動物后分離篩選單克隆B細胞，擴增其表達抗體的CDR序列構建至人源化抗體表達載體上，篩選鑒定后，生產人源化單抗。當然，生產出的候選單克隆抗體藥還必須進一步通過大量臨床前實驗和臨床實驗的嚴格驗證。

　　關于生產中和抗體的抗原的選擇（或病毒特異性藥物靶點），可以是病毒復制所用酶、宿主受體/蛋白酶、介導宿主內吞蛋白、病毒S1 RBD、S2結構域等 1。

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　　哪些靶點可能會成為未來抗2019-nCoV病毒特異性藥物靶點？

　　在考慮選擇抗2019-nCoV病毒特異性藥物靶點之前，需要我們對2019-nCoV病毒感染宿主的分子機制有充分的認識。

　　冠狀病毒進入細胞的分子機制是一個多步驟的過程：Spike蛋白介導了與宿主細胞表面受體結合，隨后宿主蛋白酶切割Spike蛋白，最后膜融合病毒進入宿主細胞 16-18。SARS-CoV病毒經Spike蛋白的RBD結構域和宿主細胞受體ACE2結合而進入宿主細胞，而不是通過宿主細胞受體DPP4和APN來介導（圖1）18,19。MERS-CoV病毒通過DPP4受體 17，HCoV-229E病毒通過APN受體 20，HKU5和PDF-2180病毒通過未知的受體進入人體細胞 21。

圖1 SARS-CoV Spike蛋白通過RBD結構域和宿主細胞受體ACE2結合 （PDB：5X5B，2AJF）19

　　目前已有三項研究（Peng Zhou等、Michael等、Markus Hoffmann等）在細胞水平上證明了2019-nCoV病毒與SARS-CoV病毒一樣，通過宿主細胞受體ACE2（血管緊張素轉化酶2），而非DPP4或APN受體來進入宿主細胞 8,18,19。而在蛋白酶切割Spike蛋白階段，對于TMPRSS2 -細胞系（如293T細胞），2019-nCoV-Spike和SARS-CoV-Spike均由Cathepsin B/L來切割Spike蛋白來介導病毒進入宿主細胞。而對于TMPRSS2+ 細胞系（如Caco-2細胞），2019-nCoV-Spike和SARS-CoV-Spike均由TMPRSS2來切割Spike蛋白來介導病毒進入宿主細胞 18，因此，可能與SARS-CoV一致，2019-nCoV病毒利用了宿主蛋白酶Cathepsin B/L或TMPRSS2來切割Spike蛋白介導進入宿主細胞的過程。

　　前述的研究表明，在體內2019-nCoV病毒和SARS-CoV病毒可能都利用了相同的宿主細胞表面受體和蛋白酶來介導進入宿主細胞的過程，提示著ACE2和TMPRSS2作為抗2019-nCoV病毒藥物靶點的潛在價值。

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　　靶向炎癥因子（或受體）的單抗藥/拮抗劑的免疫調節療法會有效嗎？

　　2019-nCoV病毒所致肺炎以單/雙側肺斑片狀或節段性磨玻璃密度影的CT表現為顯著特征之一，說明患者肺部產生病變 22。研究2019-nCoV病毒所致肺炎病理生理機制，并據此開發藥物減輕患者肺部病變癥狀和阻斷病變進展也是治療新冠肺炎重要的一部分。

　　人們發現SARS患者血清中上調的炎癥因子（IL1B、IL6、IL12、IFNγ、IP10和MCP1）與肺部炎癥和損傷存在密切的關聯 23。而MERS患者表現出了Th1和Th17反應，即IFNγ、TNFα、IL15和IL17的上調 24。上述發現不難讓人想到炎癥因子的上調也和2019-nCoV所致肺炎嚴重程度相關 22。Chaolin Huang等率先報道了2019-nCoV所致肺炎患者的血漿中的炎癥因子表達情況，作者發現不僅Th1細胞反應激活（IL1B、IFNγ、IP10和MCP1上調），Th2炎癥因子IL4和IL10也上調，除此以外，ICU患者血漿中的IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1A和TNFα要比非ICU患者的要高，暗示這些炎癥因子的表達水平和疾病嚴重程度可能相關 22。