表1 有效梯度內的采集數據分析
表2 HeLa和酵母樣本全蛋白鑒定結果
2.2 HeLa和酵母蛋白質組快速鑒定結果
數據經SEQUEST HT搜庫和Percolator卡值, 從1 μg和50 ng HeLa樣本中分別鑒定到20860和14100條肽段(q值0.01), 分別對應3865和2877個非冗余蛋白(表2), 而同樣的鑒定數量, 目前的報道至少需要2~3h[9]. 另外, 酵母樣本共鑒定到15083條肽段(q值0.01), 對應2697個非冗余蛋白(表2).
HeLa數據進一步使用Preview軟件分析譜圖質量精度(圖2). 結果顯示, 母離子(m/z)質量精度平均為0 ppm, 子離子質量精度(m/z)平均為0.075 Da. 軌道肼質量偏差基本保持在5 ppm以內, 具有高質量精度和長期穩定的質量軸; 離子阱質量偏差基本保持在±0.2 Da以內, 質量精度良好, 保證了數據的質量與結果可信度.
肽段ATAGDTHLGGEDFDNR的譜圖展示了Q-OT-qIT質譜的碎裂效果和靈敏度(圖3), 譜圖具有豐富的碎片信息、良好的匹配度和較高的靈敏度. 此外, HCD和CID兩種碎裂模式效果相當并有著各自的特點: HCD避免了CID的三分之一效應, 低分子量端信息沒有丟失, 同時速度比CID快5%; 而CID靈敏度更高, 對低豐度肽段碎裂效果更明顯.
2.3 不同碎裂模式和檢測方法比較與分析
鑒于不同模式的鑒定效果差異明顯, 實驗深入考察了HCD/CID碎裂模式和軌道阱/離子阱二級檢測方法對鑒定結果的影響. 首先分析了HeLa在OT-HCD-IT, OT-CID-IT和OT-HCD-OT3種模式下的鑒定結果, 比較其互補性. 結果表明, HCD和CID共同鑒定到的肽段占32.7%, 僅一種碎裂模式鑒定到的占67.3%; OT/IT同時檢測到的肽段占51.9%, 僅一種質量分析器檢測到的占48.1%(圖4). CID有三分之一效應, 造成低分子量端的質量歧視, HCD克服了低質量端歧視, 但靈敏度略低于CID; 離子阱具有較高的掃描速度和靈敏度, 而軌道阱的高分辨率與高質量精度有效排除了復雜樣本基質的干擾. 因此, 兩種碎裂模式和檢測方法具有一定的互補性.
實驗進一步使用OT-HCD-IT, OT-CID-IT, OT-HCD-OT和OT-CID-OT4種掃描模式, 對酵母樣本進行60 min有效梯度采集, 詳細比較了不同掃描模式的差異. 其中, 二級IT采用Rapid掃描, OT采用30k分辨率. 鑒定結果以OT-HCD-IT結果為100%歸一化(圖5). 結果表明, 由于OT-HCD-IT速度最快, 獲得的譜圖數和鑒定結果最多; CID比HCD慢5%, 因此鑒定結果少5%; OT-HCD-OT為兩級高分辨, 一級、二級無法同時運行, 譜圖數和蛋白鑒定數分別是二級IT掃描的70%和85%; OT-CID-OT速度最慢, 譜圖數和蛋白鑒定數分別是OT-HCD-IT的60%和75%. 此外, 4種掃描模式的譜圖解析率相差不大, 表明不同掃描模式對數據質量影響不大.
2.4 離子最大注入時間與自動增益控制(AGC)對結果的影響
利用C-trap控制離子的注入時間和注入數量(自動增益控制)是軌道阱質量分析器的特點, 進入軌道阱的離子數量對檢測結果影響很大, 合適的離子數量不僅避免了空間電荷效應, 還能夠明顯提升譜圖質量、動態線性范圍和檢測線. 實驗在OT-HCD-OT模式下設置不同參數對HeLa樣本進行分析(二級OT采用15k分辨率), 進一步探索不同的最大注入時間和AGC設置對結果的影響(表2).
鑒定結果表明, 當樣本濃度較高(1 μg)時, 離子數量充足, 較小的注入時間和AGC即可獲得良好的結果;增加注入時間和AGC反而會降低掃描速度, 減少譜圖數量.因此, 參數設置為1.0e5, 35 ms時獲得的鑒定數最多(圖6A). 當樣本濃度很低(50 ng HeLa)時, 需要增加注入時間和AGC以注入更多的離子, 提高靈敏度和譜圖質量; 但如果注入時間過長(120和200ms), 譜圖數量太少, 也會導致鑒定結果減少.因此, 2.0e5, 60 ms的參數設置獲得的鑒定數最多(圖6B). 此外, 注入時間越長、離子數量越多, 譜圖質量越高, 因此, 離子注入數量與譜圖解析率成正比.
圖2 數據質量精度分析
A: 一級質量精度; B: 二級質量精度