DNA酶切及凝膠電泳（gelelectrophoresis）1

第一節 概 述

一. DNA的限制性內切酶酶切分析

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割 DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為 4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端， 如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大部分限制性內切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時，會影響其進一步使用，因此在吸取限制性內切酶時，每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用，隨后調節鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應。

DNA限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。

構建DNA限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準確性和精確程度。

在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內切酶的酶解反應最適條件各不相同，各種酶有其相應的酶切緩沖液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA酶切反應而言， 限制性內切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應時間也要適當延長。

二. 凝膠電泳

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的 DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide， EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。

瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近 50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前，一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。

瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

2、瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于 DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%， DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、DNA分子的構象

當DNA分子處于不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

4、電源電壓

在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過 5v/cm。

5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15%。

6、離子強度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。

第二節 材料、設備及試劑

一、材料

λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS質料或pUC19質粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產的電泳用瓊脂糖均可。

二、設備

水平式電泳裝置，電泳儀，臺式高速離心機， 恒溫水浴鍋， 微量移液槍， 微波爐或電爐，紫外透射儀， 照相支架， 照相機及其附件。