大規模并行基因組測序技術（MPGS）在NIPT中的應用

　　據報道，全世界每年出生的各種缺陷兒約790萬，70%的出生缺陷系遺傳因素所致，而染色體異常是最常見的遺傳因素，其中21三體發病率最高，其發生機制為生殖細胞在進行減數分裂時21號染色體不分離，造成21號染色體拷貝增加。迄今為止，唐氏綜合征沒有有效的治療方法，只能通過產前篩查與早期診斷才能減少或避免患兒的出生。

　　目前臨床主要應用的產前篩查手段主要可分為兩類：（1）血清學檢查：主要包括AFP、β-hCG、游離雌三醇（μE3）、抑制素A（Inhibin-A）、妊娠相關蛋白 A（PAPP-A）等；（2）超聲影像學檢查：主要包括胎兒頸部半透明層厚度（NT）測量、胎兒鼻骨測量等。

　　應用于產前診斷的方法主要有羊膜穿刺（AC）、絨毛膜絨毛取樣（CVS）和胎兒臍帶穿刺。其基本原理為通過穿刺等手段獲取胚胎來源的組織或細胞，然后利用染色體核型分析法或 QF-PCR 法對于胚胎來源的細胞中21號染色體核型進行分析計數，從而判斷胎兒是否患有21-三體綜合征。然而由于這幾種診斷方法均為侵入性診斷，對胎兒和孕婦都會造成一定程度的創傷，甚至有約1.0%的幾率造成流產。

　　cf-fDNA的發現--無創產前基因檢測（NIPT）最理想的檢材

　　1997年Lo等首次證實母血中存在胎兒游離DNA（ cell-free fetal DNA， cf-fDNA）， 且孕育21三體胎兒的孕婦血漿中cf-fDNA平均水平比孕育正常胎兒的孕婦高兩倍左右，為產前基因診斷打開了新的篇章。他們主要采用基于Taqman探針的實時定量PCR(qPCR)對Y染色體上的特異性生物標志(SRY)進行定量檢測,同時選擇管家基因p-globin對母體血漿總DNA進行定量檢測,通過二者比值可計算出cf-fDNA含量比例。

　　孕婦血漿中游離的 DNA 分子（cfDNA）主要由孕婦血液循環中的小片段的細胞外DNA組成。cfDNA來源于4孕周左右的胎盤脫落的cf-fDNA（目前的研究認為孕婦血漿中的cf-fDNA主要來源于凋亡的胎盤絨毛膜細胞，小片段的 DNA 分子穿過胎盤屏障進入到母體血液循環中所致），以及母體的游離DNA分子，其中cf-fDNA僅占cfDNA總量的4%-19%左右。所以傳統的DNA提取技術及PCR等方法難以 對胎兒唐氏綜合征進行準確的判斷。

　　cf-fDNA片段能夠攜帶胎兒整個染色體組的遺傳信息,孕婦從懷孕第7周開始即可檢測到 cf-fDNA，在最初 3 個月內cf-fDNA含量每周增加約 21%，在隨后的3個月進入平臺期，在分娩前又迅速增加，并且在分娩后2小時內就能夠迅速被機體清除，具有妊娠特異性，且不受上次妊娠結果影響。Palomaki GE等發現母體血中cf-fDNA含量存在個體差異，不同孕周檢測結果差異很大，選擇孕中期作為采血時間進行cf-fDNA檢測較為合適。

　　到目前為止，cf-fDNA已經被廣泛的應用于胎兒性別鑒定、常染色體遺傳病如β地中海貧血、軟骨發育不全、RhD血型鑒定、非整倍體遺傳病如21三體綜合征等、性染色體連鎖性疾病如X染色體連鎖的血友病、脆性X綜合征等遺傳性疾病的無創產前檢測中。

　　大規模并行基因組測序技術(MPGS)在無創產前基因檢測(NIPT)中的應用

　　目前應用于研究cf-fDNA 的方法有很多，如實時熒光定量PCR法（qPCR）、甲基化免疫沉淀法(medip)、數字化PCR法(digitalPCR)、大規模平行基因組測序法（massively parallel genomic sequencing，MPGS）等。2008年Chiu等首次將MPGS技術應用于產前基因診斷，檢測孕婦外周血中cf-fDNA的含量。MPGS以并行運行的方式解碼DNA聚核苷酸序列，測序范圍廣，使產前基因篩查技術得到了進一步發展。2010年LUN等運用MPGS技術成功地在產前檢測出1例易位型21三體綜合征，使MPGS技術應用于21三體產前篩查成為可能。

　　MPGS技術的操作方法為，于孕12～36周時抽取5ml外周血，置于EDTA 抗凝管中， 4℃離心5min，棄沉淀，將上清液轉移至離心管中，重復上述操作1次，將所得的血漿置于－80℃冰箱中保存待用或直接提取血漿DNA（cfDNA含量較少，且多為小片段DNA分子，所以在提取過程中容易丟失，提取難度大。目前提取cfDNA 最常用的方法主要有傳統的酚-氯仿-異戊醇法，磁珠法、硅膠膜吸附柱法）。有研究結果表明，應用酚-氯仿-異戊醇抽提配合微量DNA助沉劑法可獲得較高的cfDNA含量，且提取的cfDNA 能有效地為qPCR 提供模板。提取的血漿DNA,應用T4DNA聚合酶、克列諾片段(klenowfragment)和T4多聚核苷酸激酶(T4PNL)對片段末端進行修復。在３′端加堿基A使得DNA片段與５′端帶有T堿基的特殊接頭連接。通過PCR技術擴增兩端帶有接頭的DNA片段并對產物進行純化。檢測文庫大小及產量，定量好的文庫通過與flow cell上的接頭進行雜交，擴增成cluster后進行測序，將孕婦血中所有游離DNA不論其來源全部進行測序，獲得分布在每條染色體上的真實的核酸片段數量，通過生物信息學計算出對應的覆蓋深度（測試樣本中染色體NDNA所占總DNA的比例可以表示為覆蓋深度，覆蓋深度=樣本染色體上有效測序片段總數/參考序列染色體上有效測序片段總數），將樣本中染色體深度覆蓋度與標準樣本中的深度覆蓋度進行統計分析，并計算T值，T值= 樣本深度覆蓋度－標準樣本中的深度覆蓋度/參考樣本標準差，當 T≥3 認為胎兒具有唐氏綜合征的高風險。

　　MPGS技術的優點有: ①無創取樣，感染少，更安全；②檢測周期短；③檢出率高；④所需樣本量少，只需3～5 ml母體外周血；⑤妊娠12周就可以檢測，能夠早診斷早治療 ；⑥準確性等于染色體核型分析；⑦適用對象廣，不僅包括傳統篩查方法中的高風險人群，還適用于高齡孕婦、反復流產孕婦、以及一些特殊的不適于做羊水或臍血穿刺的人群。

　　但是，MPGS技術也存在著局限性: ①不能精確檢測平衡易位型和嵌合體型21三體綜合征；；②不能精確檢測多胎妊娠，不適用于孕婦染色體為非整倍體患者。

　　無創產前基因檢測是早期唐氏診斷的關鍵平臺，它以診斷早、無創傷、確診率高、安全性強等明顯優勢成為當前國內外產前診斷領域的新熱點和發展趨勢。相信隨著技術的發展和更多臨床試驗的開展，無創產前基因檢測領域能開創更多新方法，克服局限性，替代傳統的產前檢查方法，為眾多家庭以及社會所受益。