INCSeq：提高納米孔測序準確性的新方法

　　新加坡基因組研究院（GIS）的研究人員開發了一種方法，稱為INC-Seq，能夠提高牛津納米孔技術公司掌上測序儀MinIon的測序準確性。目前他們正努力改進該方法，將它應用到復雜樣本的16S測序、RNA測序以及基因組復雜區域測序等中。

　　研究人員在近日發表于《Giga Science》的文章中描述了該方法。GIS計算與系統生物學副主任NiranjanNagarajan說，納米孔測序是一項令人興奮的技術。但是這種技術的致命弱點在于測序原始數據的準確性以及系統誤差。他的團隊希望找到一種方法來提升MinIon的準確性。

　　INC-Seq的原理

　　他們開發的方法借鑒了PacBio公司的環形一致性測序模式（circular consensus sequencing，CCS）的概念：通過對同一個分子反復測序，可以計算出一致性序列，進而提高準確性。

　　雖然納米孔測序時DNA模板必須是線性的，但GIS研究小組的方法是使用滾環擴增，來產生一個環狀的DNA分子，它由一個DNA擴增子的串聯重復組成。

　　這種方法被稱為分子內連接的納米孔一致性測序（intramolecular-ligated nanopore consensus sequencing，INC-Seq）。該方法首先需要環化模板DNA分子，然后研究人員利用滾環擴增來擴增分子，生成由多個重復單元組成的環狀分子，這些環狀分子隨后在測序前被打斷成線性DNA鏈。

　　Nagarajan說，“對來自同一原始序列的DNA reads進行多次測序，使我們可以通過計算合并這些信息，得到原始DNA序列的準確read。”

　　INC-Seq的驗證

　　為了進行概念驗證，研究人員首先將這種方法應用到16S RNA測序中，16S RNA測序是一種鑒定混合樣品中細菌的方法。16S序列可能是相似的，因此長讀長和準確讀取非常重要。

　　研究小組首先利用合成序列來驗證該方法，將INC-Seq方法和標準的MinIon測序方法產生的2D reads進行比較。結果表明，只有72%的2D reads可以比對到正確的參考序列上，88%可比對到相同物種的參考序列上。而INC-Seq產生的reads中有92%可以比對到正確的參考序列上，99%能比對到相同物種的參考序列上。

　　研究人員接下來在菌群中測試了該方法，該菌群包含了S. cristatus、S. oralis和P.micra。他們發現，利用INC-Seq進行16S RNA測序將reads的準確率提升至97%，而標準2D reads的準確率僅84%。錯配率由7.5%降低了十倍至0.7%。此外，該方法還能計算出每個物種的正確豐度。

　　研究小組接著又對一個更加復雜的菌群進行了測試，該菌群包含了10種不同豐度的微生物。利用INC-Seq技術進行16S測序能夠檢測出每個物種的相對豐度，但是對于最豐富的物種會出現一些問題，這表明該技術可能受到了擴增偏差的影響。

　　INC-Seq的改進

　　Nagarajan說，他的團隊正在改進該方法。他們正在研究使用啞鈴狀接頭，替代滾環擴增，來使相同的DNA分子進行多次測序。每個DNA分子的兩端都連接上一個發夾環，確保該分子能夠被重復讀取。

　　Nagarajan表示，這種方法比滾環擴增更好，后者容易導致偏差。例如，在滾環擴增中，有時DNA會粘在一起，有時聚合酶會從一個模板跳到另一個，這會導致來自兩個不同模板序列的混合read產生。啞鈴狀接頭方法同時還能減少運行周期，把時間從一天減少到幾個小時。

　　Nagarajan還在測試該方法的其他應用，例如RNA測序和組裝分析。他最感興趣的是將該方法應用到RNA測序中，研究復雜基因、同源異構體和大型基因家族。此外他還希望利用該技術澄清人類基因組中的一些復雜區域。

　　Nagarajan表示，如果他們能夠成功開發出啞鈴狀接頭方法，它將成為對復雜樣本進行快速16S測序的好方法，可以準確鑒定物種，甚至是株系，例如，在農田里鑒定特定的作物病原菌。

　　任何人都可以免費使用該方法。Nagarajan說，他和牛津納米孔公司在討論開發一個改進版本提供給用戶。該實驗方法非常簡單，目前已經有很多實驗室在使用它了。