【綜述】重組蛋白糖基化表征的進展與展望

　　內容

　　1. 前言：生物制品糖基化表征的重要性

　　2. 糖蛋白表征用分析方法

　　2.1 糖基化特性

　　2.1.1 多糖的直接分析

　　2.1.2 糖譜分析

　　2.1.3 N-糖的異質性分析

　　2.1.4 單糖的分析

　　2.2 多糖分析用技術

　　2.2.1 糖分離技術

　　2.2.2 多糖檢測技術

　　● 衍生/標記方式和多糖的檢測

　　● 熒光檢測

　　● MS檢測

　　● 異構形式和連接方式的分析

　　2.3 分析中的生物信息學工具

　　3. 展望

　　1 生物制品糖基化表征的重要性

　　1972年Paul Berg首次將重組DNA技術應用到蛋白生產中進而誕生了重組蛋白，藥物中便有了一個新的分支——重組治療蛋白。1982年，第一個重組蛋白重組人胰島素誕生。從此使用重組胰島素代替動物來源的胰島素成為糖尿病治療的一個重大突破。很快，很多其他重組蛋白被應用到治療一些由于體內內源性分子（如激素、酶和凝血因子）分泌缺陷型疾病。而這些重組蛋白中超過60%是糖基化蛋白。現已證明重組表達的治療型糖蛋白的糖基化類型及水平對其療效、半衰期、穩定性和安全性等均有影響。為保持批次間糖型一致性，需要穩定的生產工藝和有效的糖型表征。

　　糖基化是最常見的蛋白翻譯后修飾。這一復雜過程發生在內質網和高爾基體上。通常將多糖分為兩類：N-糖（糖通過一個N原子連接在Asn）和O-糖(糖通過O原子連接在Ser/Thr)上。因N-糖在調節生物藥品的穩定性、功能和結構完整性上具有重要作用，因此本文主要介紹N-糖。

　　N-糖主要分為3類：高甘露糖型、復合糖型、雜合糖型。高甘露糖型只含有甘露糖（下圖中M3/M5/M8）。復合糖型（圖中A3/ A2B/ FA2G2S2/FA2G2Ga1）通常包括半乳糖、唾液酸、和核心巖藻糖基。雜合糖型通常是由高甘露糖型和復合糖型的組合。由于基質和酶（糖苷酶、多種糖基轉移酶等）的不同，N-糖基化生物合成方式添加或移除：N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖、甘露糖和唾液酸等。

　　可用于生產糖蛋白的基因工程細胞有多種：細菌、植物細胞、昆蟲細胞、酵母和哺乳細胞等。采用重組技術用于生產治療性糖蛋白的細胞主要是哺乳動物細胞系，其中以CHO細胞、BHK細胞、SP2/0 和 NS0 細胞等為主。哺乳動物細胞因其具備完整的類人體PTMs功能而被廣泛用于表達治療型蛋白。其中，CHO細胞系在工業化生產中的應用最為廣泛，原因是它們具有悠久的監管記錄、易于操作、可以在化學成分限定的培養基中懸浮生長、良好的安全使用記錄等。然而，CHO細胞系的一個缺點就是表達的蛋白糖基化一致性較差，因為糖基化過程中涉及的多種酶，并且在培養過程中會隨著培養環境不同而導致其活性會發生變化，這樣就會產生不同的糖型結構，導致批次間差異大。而尤為重要的是這些糖型的變化對蛋白結構、穩定性、溶解性、清除性、活性甚至免疫源性都有重要的影響。

　　比如：

　　例一：缺失末端唾液酸殘基的治療型抗體在血液循環過程中會被快速清除，因為暴露出的半乳糖殘基會與肝細胞的脫唾液酸受體相互作用。

　　例二：末端脫去唾液酸的治療性抗體因提升了ADCC和CDC效應從而提高了抗炎癥作用。

　　例三：治療性抗體巖藻糖去除后，ADCC活性較高。

　　例四：甘露糖的改變可以影響藥物的半衰期和導致非靶向性肝毒性。

　　重組蛋白的N-糖型受培養條件影響：營養水平、溶氧水平、PH、溫度、高應激力、血清、微載體和培養基的添加物等。例如在生產過程中通過調整培養基中的錳、半乳糖和尿苷濃度可以控制N-糖的β1,4-半乳糖基化。此外，目前在重組糖蛋白的生產過程中幾個重要的糖基化控制點已經被識別，如糖基化酶（半乳糖轉移酶4）和轉運蛋白。

　　近些年的研究已經證實在細胞糖工程學領域的可調控點：利用多種基因工程策略生產特異性或是均一性糖基化修飾。例如：敲除FUT8基因的CHO細胞系建立可確保生產完整的無巖藻化的治療性抗體，具有高ADCC活性、穩定的質量和療效。最近又有一個新的方法稱作GlycoDelete，它通過縮短高爾基體內的N-糖基化路徑來減少N-糖的復雜性。如此，可產生高的N-糖一致性，但是會失去一些重要的復雜糖型。此外，酵母細胞經過人源糖基化改造后可以提供一些類人糖基化的修飾，說明糖工程學還是有一個很好的發展前景。

　　生物仿制藥的到來促使了生物制藥市場的發展。未來近十年間，隨著多種治療性抗體的ZL期滿，生物仿制藥市場將會更快發展。而生物仿制藥是要與原研藥在理化性能、功效、安全性等均保持一致，因此這種藥物理化對比性的分析需求提升了對高效分析工具的需求。

　　就大幅度減少醫療保健成本方面來說，生物仿制藥的到來對于患者和社保部門來說都會是一個很好的選擇。預估從2014 -2024年仿制藥可以給美國節省$250 billion。在歐洲和亞洲，仿制藥可以節省近40%。然而后續研究發現，開發和生產仿制藥所需要的費用并不像預期所想那么低。

　　法規方面，EMA在2005年頒布了第一個仿制藥審批指南。2011年又頒布了補充指南強調了報批途徑。同年FDA針對美國市場也出臺了相應法規。2014年12月EMA又出臺了新的報批指南，于2015年7月正式開始實施。但是就治療性重組蛋白的糖生物學方面，這些指南雖然強調其重要，但是沒有給出具體的分析指南。例如，在歐洲藥典中，對于促卵泡素的要求是只需要控制唾液酸比例，對其他具有免疫源性的糖型并沒有要求。隨著市場需求，仿制藥相關法規也會越來越一致和清晰。

　　2 糖蛋白表征用分析方法

　　EMA要求“抗體應該被完全表征”。抗體的表征包括：理化、免疫源性、生物學活性、純度、宿主細胞殘留和抗體濃度，這些與ICH要求一樣。關于N-糖分析，EMA指南中表示需關注幾種糖基化，甘露糖、半乳糖、巖藻糖和唾液酸的程度及主要糖型的分布。

　　然而只注意主要的糖型結構是不夠的。所有N-糖型都應該明確。因為一些小結構糖（如α1-3-Gal-Gal）都可能存在潛在風險。例如：2013年投放歐洲市場的infliximab仿制藥Remsima?，和原研產品糖型結果又較大差異。原研產品中有少量糖型（低于5%總糖型）含有N-乙酰神經氨酸(NGNA)和α-1,3 Gal-Gal。近來的研究也發現在仿制藥與原研藥上會有低豐度糖型的差異，特別是唾液酸的差異。這些都表明低豐度蛋白糖基化也存在潛在風險，檢測它們同樣很重要。

　　此外，針對如何對糖型進行定性和定量的分析的指南也很重要。應該包括所有的必要的分析信息：包括用于樣品準備和分析的條件和技術，原始數據、處理數據用的工具和參數等以確保在不同的實驗室中的數據可重現性。

　　治療性蛋白的 質量表征技術必須具備準確、精確、可重復、操作性強、可擴展、可達到的最高分辨率等，其具體包括以下幾個方面：

　　氨基酸分析

　　氨基酸分析可以用于驗證一級序列的正確性和無突變產生。肽譜圖可以作為一個補充驗證工具。氨基酸檢測通常是采用RP-RPLC偶聯熒光或UV檢測器用于分析酶解或是水解后的治療性抗體。常用柱后衍生方法，衍生試劑種類很多；也有用柱前衍生的方法用于分析一些復雜的生物制品。

　　肽譜圖

　　用于驗證初級序列和有無點突變。常用的流程：酶解蛋白然后進行肽段混合物分離（液相、高分辨率的串聯質譜）。UV監測只能用于分析這些變體在保留時間上的變化或是在PTM存在時的分離性。MS/MS用于確保高質量信息的收集，包括每個肽的序列信息。對于糖分析來說，糖肽分析可以提供糖基化位點和異質性的相關信息。

　　重鏈、輕鏈、Fab、和FC片段的分析

　　用于分析抗體在每個亞基上的水平，它是肽譜圖檢測的一個補充。通過木瓜蛋白酶、胞內蛋白酶Lys-C、胃蛋白酶、免疫球蛋白G-降解酶等將抗體消化成亞基，然后用HRMS來檢測亞基水平。HRMS也可以分析N-糖構型和微小變異識別。

　　完整蛋白分析和電荷異構體檢測

　　用于分析C-末端Lys變化、Asn脫酰胺基作用、唾液酸和其他變異體。常用的檢測設備是IEC偶聯UV檢測器。現在IEC技術已經得到改進，主要是洗脫時采用不同的PH梯度替代傳統的鹽梯度，這樣可以提升分辨率。目前RPLC偶聯HRMS技術已經廣泛用于完整蛋白分析。

　　聚合體的檢測（蛋白的二聚體和多聚體）

　　聚合體對治療性蛋白的制劑和穩定性具有重要的影響。甚至由于存在某一聚合體可以明顯的改變蛋白的特性，如療效和免疫源性。聚合體通常用SEC檢測，因為SEC速度較快且重現性良好。

　　2.1糖基化特性

　　基于糖基化修飾對治療性蛋白活性和免疫源性的可能影響，現在治療蛋白的糖基化分析已經列入法規。 檢測內容包括：糖序列的確定、鏈接類型、糖連接在蛋白上的位點、大小異質性等。

　　2.1.1 多糖的直接分析

　　對糖異質體快速分析需求的提升促進了生物制藥糖分析技術的快速發展，現在CE-HR-MS和LC-HR-MS技術已經廣泛應用到該分析。CE可以檢測出糖蛋白中的單個完整糖鏈，例如氧化的和乙酰化的糖異構體等。MS的高分辨率更進一步確保完整分子的分析。如采用RPLC HR-MS 分析的還原trastuzumab的重鏈信息（見下圖）。

　　還有采用CZE-ESI-MS分析完整糖蛋白的方法來檢測促紅細胞生成素的少量糖修飾，具有較好的糖型分離效果和高敏感性。此外還有采用cIEF偶聯MALDI-TOF-MS分析VEGF的應用。完整抗體的直接分析方法可以對非完整N-糖比率進行定量分析，但是該方法難以分辨低豐度的糖，因此還需要用糖譜法做一個補充分析。

　　2.1.2 糖譜分析

　　糖譜分析需要將糖從蛋白上解離下來。最直接有效的方法就是采用PNGase F酶解N糖的方法。PNGase F催化GlcNAc和Asn殘基分開，該法基本上可以分離大多數的N-糖蛋白，但是不能分開連在GlcNAc的還原末端α1-3位含有巖藻糖的殘基，這種情況下就要選擇PNGase A，這種構型通常會發上在昆蟲細胞和植物細胞表達的產物上。某些情況下，在采用PNGase F/A酶解之前，可以先用蛋白水解消化以提升后續酶解效率（如下圖）。酶解之后采用LC或是CE進行糖分離。二者也可偶聯到相應的檢測器（熒光/MS/MALDI-TOF）上進行分析。MALID-TOF也可以用來進行糖譜分析，這種情況下不需要事先進行糖分離。

　　糖譜在面對同分異構體的檢測時具有很大的挑戰性。在這種情況下可以先使用外切糖苷酶將糖酶解然后再分析，這樣可以分析單糖、連接方式和異構體。糖苷可以采用LC-Fluorescence，LC-ESI-MS or MALDI-MS 進行分析。采用不同的特異性外切糖苷酶逐步消化糖鏈，然后使用LC-Fluorescence、LC-ESI-MS 或者是MALDI-MS檢測。采用外切糖苷酶消化的方法的一個限制就是需要分析人員具有較高的專業知識。常見的糖型分子式和Mass信息見下表。

　　2.1.3 N-糖的異質性分析

　　分析N-糖的異質性時需要先將完整性糖蛋白消化分解成糖肽，然后采用LC-HR-MS/MS分析。目前已經證明使用CID串聯MS分析糖肽在表征N-糖微觀(Microheterogeneity)異質性上效果很好，但是分析數據較難，不但需要很強的專業知識而且還很耗時。替代CID的一種方式是ETD串聯MS，它可以裂解糖肽的肽骨架，同時即可以分析氨基酸序列又可以明確其糖基化位點。如采用LC-ETD-QTOF-MS成功用于表征trastuzumab 和 erythropoietin。

　　此外，采用18O標記的糖基化位點鑒定技術，對于宏觀異質性(macroheterogeneity)分析也有一定的效果。

　　2.1.4 單糖的分析

　　單糖分析是最簡單的一種糖表征，可以確定糖蛋白中單糖的類型和相對百分比。常用的單糖的制備流程是：酸性條件下水解2-4h(80-100 ℃)，然后采用AEC偶聯PAD或是MS。PAD主要用于分析非酸性糖，并且具有高敏感性和良好的基線分離。單糖也可以用CE進行分離。

　　分析單糖的另一個優點就是可以研究其連接方式。實際上，在多糖完全甲基化后，使用electron-impact-GC-MSMS分析，可以獲得特異性的單糖。這種方法是基于已知特異性（帶有不同乙酰基標簽）單糖的保留時間。這些方法也可以提供較多的連接信息。

　　2.2多糖分析技術

　　2.2.1 糖分離技術

　　多糖和糖肽在檢測之前通常先用LC和CE進行分離。LC的方法時基于被分析物在流動相和固定相中的分布，而CE的方法則是基于被分析物在電場中的移動速率，和電荷情況，分子大小及分子結構相關。兩種方法具有可比性，均具有較高的精度和準確性。

　　用于分離糖的液相方法較多。HILIC相對是比較受歡迎的一種，因為與RP-LC相比，其溶質擴散系數更高，高保留、分辨率、敏感性和良好峰型。下圖（圖4）顯示了HILIC分離多糖的色譜圖。缺點是該方法使用的流動相是高濃度乙腈，對環境有害。

　　弱陰離子交換色譜(Weak Anion Exchange, WAX)可用于帶電荷的多糖異構體分離，如具有不同數量的唾液酸異構體殘基，硫酸化和磷酸化的多糖等。Nano-LC系統用于小體積樣品的糖分離。另外還有芯片分析技術、芯片結合Nano-LC分析等。不同方法的對比見下表。

　　2.2.2 多糖檢測技術

　　由于多糖在UV條件下吸收很弱。因此多糖的檢測通常用質譜或是衍生后用熒光檢測器進行檢測。

　　2.2.2.1衍生/標記方式

　　為增加檢測的靈敏度，有幾種結構性修飾方式：完全甲基化、唾液酸修飾、自由還原端的還原或還原端增加熒光標記（2-AA、2-AB、苯胺或是APTS、同位素）等。

　　標記方式的選擇依賴于多糖分析平臺的選擇，并且標記對多糖的分離也很重要。比如完全甲基化可以增加多糖的疏水作用進而可以采用RP-LC分離，然其疏水作用的增強也可能導致不能完全有效分離。采用2-AB標記消除了負電荷進而可以采用HILIC檢測。APTS標記帶有強負電荷而選用CE分離。

　　近來針對N-糖推出了一種新的標記方式。采用一個叔胺—NHS氨基甲酸酯與PNGase F結合快速標記后進行LC-FLR-MS分析。該方法優點是標記快，可用于日常的批間產品分析。缺點是它會與釋放的多糖的末端氨基反應，該反應不穩定，因此該過程需要快速操作。此外還存在不能有效的標記或是酶解反應不充分（孵育時間短）的缺點。因此這種方法不太適合用于分析新的生物制品。

　　采用LC方式分離時預先對N-糖末端還原是非常重要的。如果不還原，閉環和開環均存在，在分析時同一個N-糖會有兩個色譜峰（見下圖）。末端GLcNAc還原成其相應的醇會避免這種現象的產生，但是也會阻止還原末端與光學/熒光檢測試劑的衍生反應。

　　熒光檢測器和MS結合不但可以檢測到單的熒光圖譜而且可以收集每個色譜峰的MS信息。

　　2.2.2.2 熒光檢測

　　對于糖分析來說，熒光檢測的靈敏度高于MS，但MS可以進行多糖的結構性分析。熒光檢測器通常需要其他實驗輔助，例如預先將使用外源糖苷酶釋放糖鏈，而且需要借助數據庫才能確定結構信息等。目前采用LC偶聯熒光檢測器分析2-AA或是2-AB標記的N-糖已經成為一種標準的技術。

　　與MS相比，采用熒光檢測器方法的一個缺點就是需要對糖進行標記，因此需要耗時準備樣品，而且標記時熒光試劑過量，標記完后還需去除多余的熒光試劑。通常采用SEC或是SPE去除，但是這個去除標記的過程耗時且會損失樣品。

　　2.2.2.3 MS檢測

　　最近有不少綜述介紹使用MS分析糖，如：MALDI-MS, direct ESI-MS/(MS), LC-ESI-MS, CE-MS, and IM (ionmobility)-MS等（V. Dotz, et al.,TrAC Trends Anal. Chem. 73 (2015) 1e9），內容主要就分離原理等進行介紹，本文就不再贅述。本文主要著眼于怎么選擇或是使用MS，如分析糖之前

　　應該明確：

　　● 是用正電荷方式還是用負電荷方式

　　● 一個MS還是需要串聯MS

　　● 是否需要高分辨率MS

　　● 數據收集方式

　　● 用哪種數據分析工具

　　下圖顯示了FA2, FA2G1, 和 FA2G2S1的MS/MS圖譜：

　　數據收集時采用正電荷方式或是負電荷方式是非常重要的。正離子模式比較敏感，但是負離子模式可以提供更多的信息，如鹽藻糖的位點等。但是對于中性N-糖很難采用負離子方式。目前N-糖的完全甲基化方法結和RP-LC-MS可以解決這中性N-糖的分析和唾液酸化的N-糖分析。

　　與蛋白相比，N-糖比較穩定。目前采用LC-MS的方法分析N-糖即使在強降解條件下糖的穩定性仍然很好。但是在使用MS分析N-糖時糖樣可能會發生分解或是重排，特別是在末端含有唾液酸或是巖藻糖的糖，在使用CID MS/MS檢測時非常不穩定。目前有幾種衍生方式以提升上述情況下糖的穩定性。其中最有效和常用的就是完全甲基化方法，這種方法可以在MS/MS的條件下避免糖的重排或是末端唾液酸/巖藻糖的丟失。

　　2.2.2.4 異構形式和連接方式的分析

　　有些多糖具有復雜的異構體形式。要區分這些異構體就需要詳細的結構表征。通常是先用外切糖苷酶消化，然后采用LC-MS/MS或是LC偶聯熒光檢測器進行。近來發現離子淌度MS（IM-MS）用于分析糖同分異構體效果較好。

　　2.3分析中的生物信息學工具

　　由于糖組學還處于初始階段，生物信息學工具在糖組學數據處理中的應用還有很大的提升空間。目前糖數據分析需要具備較高糖生物學知識的專業人員及大量的手動輸入。先進的糖基化表征方法體現在新的數據庫和生物信息工具方面。數據庫可為分析人員分析糖基化表征時提供幫助。目前已經有幾個含有N-糖和O-糖結構的數據庫，如Carbbank、EUROCarbDB, GLYCOSCIENCES.de, KEGG，CFG's Glycan Structures Database和GlycoBase Database, etc. 但是目前還缺少一種可以使數據處理更為簡單的軟件。

　　3 展望

　　隨著治療性糖蛋白市場的指數增長，糖蛋白的理化分析也越來越重要，相應的糖基化表征也會日益重要。這種背景下，就需要更為有效的、快速的分析方法和好的統計學方法。

　　近些年在多糖和糖肽分析、衍生、分離和檢測等領域已經有了很大的進展，而且仍然在快速發展。糖基化分析的流程從1周已經縮短至幾個小時。

　　但是目前還有一些問題存在：

　　1. 一些方法的敏感性仍需要進一步提升。

　　2. 數據處理仍需要進一步提升，以簡化數據分析和提高數據分析速度。

　　3. 對于糖基化表征的指導性法規尚不完善。

參考文獻

A. Planinc et al. Analytica Chimica Acta 921 (2016)，來源： Bioprocess|劉華杰