神器——冷凍電鏡“亂入”材料圈？

　　說起冷凍電鏡，小編想不管是研究生還是教授大咖，可能和科研有那么一丁點聯系的人對這個名字都不會陌生，因為它實在太出名了！基于冷凍電鏡產出的科研成果很多都發表在Nature、Science、Cell等頂刊上（羨慕臉），堪稱NSC神器。冷凍電鏡技術的發展直接帶動了生命科學領域，特別是結構生物學的飛速發展，今年更是不負眾望（欺負我大化學）一舉拿下了“炸藥”化學獎！不過，這些都不重要，畢竟他是隔壁生物家的孩子，以路人甲的姿態（羨慕但是我不表現出來）看看就好，反正也用不上！沒想到一個晴朗的日子，還有些風和日麗的，Stanford的崔大神（崔屹）硬生生把它拽進了我大材料圈，而且一鳴驚人，搞了篇Science！（就問你服不服）聽到這個消息，小編不禁陷入了深深的沉思，都是做材料的，怎么差別就這么大呢？（隔壁桌小林：人家是大牛！年輕的大牛！你，呵呵~）然而，短暫的沉思之后，小編知恥而后勇，決定好好看看這個“亂入”我材料圈的隔壁生物家的孩子，萬一大老板某天心血來潮也弄了一臺放實驗室了（大老板：我就呵呵不說話），那小編豈不是有大大的優勢，機智如我！獨機智不如眾機智，所以下面，小編帶大家共同了解一下這把生物圈的屠龍寶刀——冷凍電鏡！

　　1. 什么是冷凍電鏡？

　　冷凍電鏡，全稱冷凍電子顯微鏡技術（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）（我大材料的小伙伴也快好好記住這個單詞，相信不就的將來就會成為檢索材料學文獻的熱門關鍵詞），是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫環境下利用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，再經圖像處理和重構計算獲得樣品三維結構的方法[1]。圖1就是中科院生物物理研究所的FEI Titan Krios 300kV冷凍電鏡，據說單臺應該在600萬美元以上。經過30多年的發展，冷凍電鏡甚至超越了X射線晶體學、核磁共振（NMR）支撐起了高分辨率結構生物學研究的基礎。

　　那么為什么需要冷凍電鏡技術？眾所周知，X射線晶體學是解析結構的經典方法，然而它需要獲得生物樣品單晶，生物大分子的晶體生長卻十分困難；而與此同時，材料學研究中早已使用電鏡直接觀察到了原子像[2]（作為一名材料汪，TEM、SEM的重要性我想無需贅言），于是生物學家也想用電鏡給生物大分子拍一張高清照片，解析其結構，以理解其生化反應機制，然而事情沒有那么簡單，電子顯微鏡在生物領域的應用受到了嚴重限制：（1）生物樣品含有豐富的水，而透射電鏡的工作條件是高度真空的；（2）高能電子束會嚴重破壞生物樣品；（3）生物樣品主要是C、O、N、H等輕元素，對電子的反射和散射與背景相似，獲得圖像襯度很低；（4）蛋白質分子會漂移，導致圖像模糊。經過眾多科學家的長期努力，不斷克服種種困難，冷凍電鏡技術終于發展了起來，實現了溶液里生物分子高分辨率的結構解析，使得生物化學進入了一個新時代，其中3位有開創性貢獻的科學家因此榮膺2017年諾貝爾化學獎。他們分別是：瑞士洛桑大學Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學Joachim Frank教授和英國劍橋大學Richard Henderson教授。冷凍電鏡技術給出的生物大分子高清照相的方案是[1]：樣品冷凍→低劑量電子冷凍成像→三維重構。

　　（1）樣品冷凍

　　樣品冷凍其實是科學家們很早就想到的思路，但是冷凍之后樣品中水分子形成冰晶，不僅產生強烈電子衍射掩蓋樣品信號，還會改變樣品結構。直到1974年，Kenneth A. Taylor和Robert M. Glaeser在-120℃觀察含水生物樣品時未發現冰晶形成，而且發現冷凍樣品能夠耐受更大劑量和更長時間的電子輻照，才為樣品冷凍帶來轉機。而上面提到的Jacques Dubochet老爺子則更進一步，發現了水的玻璃態，成功解決了冷凍電鏡制樣問題，如圖3 （a）所示[1]。

　　（2）低劑量電子冷凍成像

　　材料汪都知道一般做TEM、SEM的時候，樣品導電性越好，電子劑量越高，成像質量越好。然而，高劑量電子對生物大分子卻是毀滅性的，因此Richard Henderson教授提出在低溫下用盡量低的電子劑量成像。他與其合作者先后在1975年和1990年重構出了粗糙的（7?）和高分辨率（3.5?）的細菌視紫紅質蛋白的模型，如圖4所示，證明了冷凍電鏡用于生物大分子高分辨率結構解析的可行性。然而，這個歷時15年的進步與早在1984年就獲得膜蛋白3.0 ?分辨率原子模型的Hartmut Michel等人（1988年諾貝爾化學獎獲得者）相比似乎仍顯遜色。盡管情況不容樂觀，但是Henderson教授仍不斷從理論上指導冷凍電鏡技術的發展并預言：隨著電鏡技術和制樣水平的發展，冷凍電鏡必將成為疑難樣品和非結晶生物大分子結構解析的有力工具。

　　（3）三維重構

　　做過TEM的小伙伴都知道，透射電鏡得到的是二維投影圖像，要得到三維的結構，就要通過一系列建模、變換，這個過程就是三維重構。上面提到的第3位諾獎得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非對稱顆粒從二維投影到三維結構的方法（隨機圓錐傾斜法），奠定了冷凍電鏡單顆粒三維重構的基本原理，如圖3（b）所示[3, 4]。隨后，開發了SPIDER程序用于冷凍電鏡結構分析，得到了廣泛應用。目前，冷凍電鏡領域廣泛應用的三維重構軟件是上面劍橋大學Richard Henderson老爺子實驗室的Sjors Scheres博士（據說當時Sjors Scheres博士沒有一篇NSC論文，但Richard Henderson教授仍獨具慧眼將其引進到劍橋MRC分子生物學實驗室）開發的RELLION。

　　然而，即便打通了任督二脈（上述3個關鍵流程），冷凍電鏡并沒有立即獲得今天這樣的爆紅。這主要是因為（1）冷凍電鏡的信噪比低，（2）圖像攝取時漂移，使得可以獲取的二維投影仍是模糊狀態，因此僅能應用于有限的生物大分子單顆粒的結構解析，嚴重限制了其應用。直到2013年，加州大學舊金山分校（UCSF）的程亦凡教授等將直接電子探測器（DDD）用于記錄冷凍電鏡的單顆粒圖像，大大提高了信噪比與分辨率，實現了近原子分辨率（3.3 ?）的膜蛋白結構的解析，才引起了業界的轟動，如圖5所示。隨后，冷凍電鏡技術在生物大分子3D結構解析中無往不利，堪稱屠龍寶刀。目前，美國NIH的Subramaniam實驗室成功解析了谷氨酸脫氫酶的結構，分辨率達到了1.8 ?，創造了最高分辨率的世界紀錄。

　　可見，正是3位諾獎科學家在各自領域內完成突破性的工作：Jacques Dubochet突破了冷凍技術的瓶頸，Joachim Frank在三維重構算法上做出了原創性貢獻，Richard Henderson首次使用低電子劑量成像完成了生物大分子3D結構的解析并一直在理論上指導冷凍電鏡技術的發展，最終形成了0到1的飛躍，鑄造了冷凍電鏡這一把屠龍寶刀，開創了結構生物學研究的新局面。上述3位科學家獲得諾貝爾獎章可以說當之無愧！

　　2. 冷凍電鏡在結構生物學中的戰績

　　從NSC等頂刊的發文情況及源源不斷的生物大分子結構被解析出來，冷凍電鏡在結構生物學領域取得的巨大成功無需贅述。單單以中國大陸為例，基于冷凍電鏡技術在結構生物學領域取得的重大進展就十分可觀，具體如表1所示[5]（2016年）。而隨著冷凍電鏡技術的大熱，國內的許多高校、科研院所紛紛花重金購進冷凍電鏡設備，已經有超過24家獨立實驗室在采用冷凍電鏡進行蛋白質等生物大分子的3D結構解析研究，如圖6所示[5]。

　　3. 冷凍電鏡在材料科學中嶄露頭角

　　小編沒有查到在崔屹教授之前將冷凍電鏡技術應用到材料科學領域的報道，但是不管有沒有，以Stanford的崔屹教授2017年10月27日在線發表在Science這篇題為“Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo-electron microscopy”的研究論文 [6]作為冷凍電鏡在材料學研究中的一個開端，小編認為是合適的，畢竟它是“他山之石，可以攻玉”的一個典范，可以說開啟了材料科學研究的一個新世界。

　　做鋰電的小伙伴都知道，鋰枝晶是鋰電中最大的安全隱患，Samsung、Apple產品時不時出現的自燃事故和它不無關系。時至今日，枝晶的產生、生長以及刺穿隔膜造成電池內部短路，都是電池專家們不得不直面的問題，也是材料領域“持續高溫”的研究方向。然而，眾所周知，鋰元素非常活潑，對環境極其敏感，如何從原子層面去研究鋰枝晶的形成和生長，極具挑戰。傳統的高分辨TEM電子束能量很高，會嚴重損壞枝晶結構甚至熔毀；而低分辨的TEM、直接成像、表面探針等技術獲得的信息又十分有限。在這篇Science論文中，崔屹教授等受“冷凍電鏡可以獲得脆弱的生物大分子原子級別結構”的啟發，創造性地將冷凍電鏡技術引入到了敏感性電池材料和界面精細結構的研究中，克服了電池材料冷凍制樣的種種難題，首次獲得了鋰枝晶原子分辨率級別的結構圖像。結果顯示，冷凍電鏡技術完整地保留了枝晶的原始形貌及相關結構、化學信息，在持續10min的電子束轟擊下仍然保持完好。高分辨的Cryo-EM照片表明鋰枝晶是呈長條狀的完美六面晶體，完全迥異于傳統電鏡觀察到的不規則形狀；而其生長行為顯示其有明顯的<111>優先取向，生長過程中可能發生“拐彎”，但是并沒有形成晶體缺陷，不影響其完美晶體結構。另外，研究結果還包含固態電解質界面（SEI）的組成與結構。崔屹教授表示，研究結果十分令人興奮，證明了Cryo-EM可以有效地對那些脆弱、不穩定的電池材料進行高分辨率表征，例如鋰硅、硫等，并且保持它們在真實電池中的原始狀態。

　　小編在查閱文獻過程中，也發現了另一篇采用Cryo-EM研究鋰電池的論文“New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium Metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM”，由美國加州大學圣地亞哥分校（UCSD）的孟穎教授（Ying Shirley Meng）等人發表在Nano Lett.上，發表時間為2017年11月1日，在線發表僅比崔教授的Science大作晚4天。文章[9]同樣是采取了冷凍電鏡技術穩定了電化學沉積的活潑的鋰金屬，同時減少電子束帶來的損傷，然后對其納米結構、化學組成以及固態電解質界面進行了研究。可以說和崔屹教授異曲同工，證明了Cryo-EM是研究對電子束、熱敏感的電池材料強有力的工具，能夠從最基礎的層面獲得相關信息。

　　除了上述兩篇將Cryo-EM用于鋰電池中敏感電池材料及SEI研究的論文外，就小編有限的認知，可能在有機/無機雜化鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點等精細結構、中間態的表征中，Cryo-EM將具有的優勢也是不言而喻的。可以預見，不久的將來，這些對電子束、熱敏感的活潑材料的原子級別的表征可能會是Cryo-EM在材料領域應用的潛力方向。

　　4. 總結

　　2017年10月4日，諾貝爾化學獎一公布就引起了朋友圈的瘋狂調侃，認為：冷凍電鏡是授予物理學家的化學獎以獎勵他們對生物領域的杰出貢獻，讓眾多化學汪深以為然。現在，崔屹教授的Science論文和孟穎教授的Nano Lett.論文終于讓這個化學獎多了一些化學的意思了。這種隔壁生物家的孩子“跨界”材料圈完成的令人興奮的工作已經隱隱有撬動材料學相關研究的苗頭了。小編相信，這項引領生物化學研究進入新時代的技術，攪動我大材料江湖也是指日可期！