化學發光技術（CLIA）綜述

化學發光免疫測定（CLIA）是將抗原與抗體特異性反應與敏感性的化學發光反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。

（一）原理

化學發光免疫測定（CLIA）屬于標記抗體技術的一種，它以化學發光劑、催化發光酶或產物間接參與發光反應的物質等標記抗體或抗原，當標記抗體或標記抗原與相應抗原或抗體結合后，發光底物受發光劑、催化酶或參與產物作用，發生氧化還原反應，反應中釋放可見光或者該反應激發熒光物質發光，最后用發光光度計進行檢測。

（二）特點

特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩定、可自動化。

（三）分類

1、從反應原理上，化學發光免疫技術主要分為直接化學發光和酶促反應化學發光。

1.1直接化學發光

化學發光劑在發光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發光反應，它們在化學結構上有產生發光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。直接化學發光速度快、試劑穩定性好，但靈敏度略低于酶促發光。

代表性的發光劑有：吖啶酯、三聯吡啶釕。

1.1.1  吖啶酯

在堿性條件下被H2O2氧化時,發出波長為470nm的光，具有很高的發光效率，其激發態產物N-甲基吖啶酮是該發光反應體系的發光體。

這類化合物的發光為閃光型，加入發光啟動試劑后0. 4s 左右發射光強度達到最大，半衰期為0.9s左右。

特點：

①發光反應中在形成電子激發態中間體之前，聯結于吖啶環上的不發光的取代基部分從吖啶環上脫離開來，即未發光部分與發光部分分離，因而其發光效率基本不受取代基結構的影響。

②吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物化學發光不需要催化劑，在有H2O2 的稀堿性溶液中即能發光。因此應用于化學發光檢測具有許多優越性。

優點主要有：

①背景發光低，信噪比高；

②發光反應干擾因素少；

③光釋放快速集中、發光效率高、發光強度大；

④易于與蛋白質聯結且聯結后光子產率不減少；

⑤標記物穩定（在2-8 ℃下可保存數月之久）。

1.1.2.三聯吡啶釕

三聯吡啶釕 [RU(bpy)3]2+是電化學發光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時失去一個電子而發生氧化反應。

1.2 酶促反應化學發光

是利用標記酶的催化作用，使發光劑（底物）發光，這一類需酶催化后發光的發光劑 稱為酶促反應發光劑。酶促化學發光靈敏度高，但速度慢，酶活性容易受外界影響，其代表性的發光物質有魯米諾及其衍生物、AMPPD

1.2.1.    魯米諾及其衍生物（HRP)

激活酶為辣根過氧化物酶（HRP)，魯米諾體系的發光基本上為閃光型且信號弱。但在使用增強劑的情況下，發光的持續時間可延到30-60min，發光強度至少增加100倍以上。

現通常采用的體系是Luminol/H2O2/HRP體系，即用HRP標記抗原或抗體，以魯米諾或異魯米諾及其衍生物作發光底物，對碘苯酚或對苯基酚等作增強劑，用NaOH+H2O2作發光啟動試劑，化學發光反應2min后，光反射強度達到最高峰；20min后，光強度減少20%。

1.2.2.    異魯米諾（ABEI）

新產業的化學發光使用的發光劑，使用的是閃光非酶激活技術，加入啟動液后測試0.1-3s時間內的發光強度。

1.2.3．   AMPPD (AP)

激活酶為堿性磷酸酶（AP）

AMPPD的特性：

(1) 在堿性環境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；

(2) 熱穩定性好，在pH=7.0的水中，30℃時的分解半衰期為142h；

(3) 發光為輝光型，波長為470nm，在15min時強度達到高峰，15-60min內光信號強度維持一致，變化很小，即使在12h后仍能測定得出正確結果；

(4) 加入增強劑如聚氯芐乙烯芐基二甲基銨(BDMQ)或BSA等，能明顯增強AP酶解AMPPD的發光強度，增強因素達100-100000倍。

現通常采用的體系是Dioxetane/AP/Enhance System，即用堿性磷酸酶(AP)標記抗原或抗體，用(金鋼烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作發光底物，在發光底物中加入增強劑。

使用此系統的有美國DPC公司的Immulite System和Beckman Coulter公司Automated Immunoassay System等，邁瑞的化學發光所使用的底物基本上屬于AMPPD。

2、從固相載體上，一般分為板式分離和磁珠分離

2.1 板式分離技術：

將抗原/抗體包被在微孔板上，反應時，待檢物質通過抗原抗體反應結合于包被板上，通過洗滌液數次洗滌，實現結合部分和未結合部分的分離，后加入底物、啟動試劑，用光電倍增管檢測發出的光信號。

此分離技術和酶聯免疫分析技術（ELISA）一致,只是將最后的顯色劑改為發光劑得以實現，多數手工法檢測，及部分半自動儀器使用這種分離技術，由于抗原抗體結合在反應孔中，反應面積有限，所以為達到充分反應，孵育時間一般比較長。常為0.5h~2h。

手工法化學發光最常用的發光體系是魯米諾/H2O2/增強劑，規格和ELISA基本一致，為48T/96T。

2.2 磁珠分離技術

超順磁珠是一種表面帶有特定活性基團、大小均勻、 球形、具有超順磁性及保護殼的微粒。超順磁珠在有外磁場存在時表現出磁力而發生聚集，無磁場時又失去磁力而分散開來。

通過一定的方法可將抗原/抗體等活性物質和磁珠表面的活性基團結合而包被于磁珠上面，檢測時，將待檢物和包被有抗原/抗體的磁珠在一定條件下孵育，通過抗原抗體反應結合，后通過增加外部磁場，磁珠產生磁性而聚集在一起，即可進行洗滌，實現結合部分和未結合部分的分離，最后加入底物、啟動試劑，用光電倍增管檢測發出的光信號。

使用磁珠法分離，由于反應時磁珠均勻分布于整個液體中，反應面積較大，更容易充分反應，故孵育的時間較短。

（四）一些自動化儀器使用的方法原理：