唐本忠團隊：水溶性AIEgen用于生物成像與光動力治療

　　具有近紅外區聚集誘導發光 (AIE) 特性和治療診斷功能的水溶性 AIEgen（具有 AIE 性質的分子）一直是人們追求的目標，但前進的道路依然極具挑戰性。近日，英國皇家化學會旗艦期刊 Chemical Science 發表了唐本忠院士團隊（香港科技大學）與華南師范大學胡祥龍研究員、鄭州大學第一附屬醫院蘇會芳博士、深圳大學 AIE 研究中心王東博士等合作完成的前沿論文 (Edge Article)，首次報道了一種具有良好水溶性并能在近紅外區發出強烈 AIE 熒光的 AIEgen。

　　這種 AIEgen 能夠特異性地『照亮』細胞膜，而且在成像前無需洗去多余的熒光分子。在細胞培養基中加入 AIEgen 后，在室溫下僅需晃動幾秒鐘就可以完成染色操作。這是首次報道能同時實現超快染色（秒級）和免洗脫操作的熒光『染色』分子。此外，本文還報道了所述 AIEgen 在可見光照射下高效生成活性氧物質 (ROS) 的研究工作；如此，該 AIEgen 不僅能成像，還能作為一種優異的光動力探針，實現腫瘤細胞的高效光動力殺傷。另外，由于該 AIEgen 能夠穩定持久染色細胞膜，因此有望用于活體腫瘤的持久成像和治療。

　　Rational design of a water-soluble NIR AIEgen, and its application in ultrafast wash-free cellular imaging and photodynamic cancer cell ablation

　　Dong Wang, Huifang Su, Ryan T. K. Kwok, Xianglong Hu*, Hang Zou, Qianxin Luo, Michelle M. S. Lee, Wenhan Xu, Jacky W. Y. Lam and Ben Zhong Tang*

　　Chem. Sci., 2018, Advance Article

　　DOI: 10.1039/C7SC04963C

　　非常感謝論文作者對本報道給出的修改意見！

　　研究背景

　　大顯神威的 AIE

　　作為一種強大的非創傷性成像技術，熒光生物成像取得了長足的進步。作為其中主要使用的一類熒光生色團，有機小分子熒光生色團化合物也獲得了很大的發展。得益于穿透深度大、生物自發熒光干擾少、對生物體造成的光損傷極小、光散射弱等特點，熒光激發波段位于近紅外區（NIR，波長 > 700nm）的有機小分子化合物尤其受到關注。

▲ 各類有機小分子熒光團化合物：最大激發波長與熒光強度 ACS Chem. Biol., 2008, 3,142-155

　　然而，由于 π-π 堆積和其它非輻射衰變渠道的存在，傳統的 NIR 熒光生色團在高濃度或聚集狀態下只能發出較弱的熒光，或者完全不發光。上述這種熒光猝滅的主要原因跟聚集體的形成有關，故常被稱為『聚集導致熒光猝滅』(aggregation-caused quenching, ACQ)。這種現象在生物成像和分析中非常常見，并且已經成為了影響實際應用的一個主要障礙：由于其發光中心的高疏水性，有機分子在生物介質中會自發地聚集在一起。

　　2001 年，唐本忠課題組發現了一個奇特的現象：一些噻咯分子在溶液中幾乎不發光，而在聚集狀態或固體薄膜下發光大大增強。因為此發光增強是由聚集所導致的，故被形象地將稱為『聚集誘導發光』(aggregation-induced emission, AIE)。

大部分的常用熒光生色團化合物（如熒光素）在溶液狀態下是強發射體。然而，由于 π-π 堆積作用，其熒光發射在聚集狀態或固態下被淬滅。如四苯基乙烯 (TPE) 這樣的AIE 生色團呈螺旋槳形，在形成聚集體時就會發射熒光。固態的 TPE 能發射很強的熒光。Mater. Horiz., 2016, 3, 283-293

　　得益于 AIE 現象的發現，傳統 NIR 熒光生色團在生物成像時的 ACQ 問題有了一個完美的解決方案。AIE 熒光生色團 (AIEgens) 在稀溶液狀態時是沒有熒光發射的，但在聚集狀態下表現出強烈的熒光。因此，無論溶液的濃度有多高，AIEgens 都可以作為熒光探針來實現生物傳感和成像方面的應用。

在溶液狀態下，HPS 分子外圍的苯環可以通過單鍵繞中心的噻咯自由旋轉，這個過程以非輻射的形式消耗了激發態的能量，導致熒光減弱甚至不發光。在聚集狀態下，HPS 分子的“螺旋槳”式構型可以防止 π-π 堆積，抑制熒光猝滅；同時由于空間限制，HPS 分子內旋轉受到了很大阻礙，這種分子內旋轉受限抑制了激發態的非輻射衰變渠道，打開了輻射衰變渠道，從而使熒光增強。Chem. Sci., 2015, 6, 5347-5365

　　在目前階段，近紅外波長的 AIEgens (NIR AIEgen) 的發展還較為有限，僅有少量的高性能 NIR AIEgen 見于報道并被用于生物學研究。另外，迄今為止尚未見水溶性 NIR AIEgens 的報道。考慮到生物學研究是在生理環境（或水性介質）中進行的，水溶性 AIEgens 在這方面就會有很大的優勢。因此，開發具有良好水溶性的 NIR AIEgens 仍然是一項重要且具有挑戰性的工作。

　　細胞膜熒光成像不簡單

　　細胞膜參與各種細胞過程和生物功能，如細胞信號傳導、細胞粘附、內吞、胞吐和物質的選擇性滲透等；因此，細胞膜對細胞來說不可或缺，而通過對細胞膜進行觀察還可以得出與細胞狀態和疾病相關的許多信息。鑒于此，應用熒光生物探針分子的細胞膜體外 (in vitro) 成像技術具有著重要的實際價值。

▲ 細胞膜的磷脂雙層結構及膜蛋白的輸運 Source: Membrane Transport @ Gfycat

　　然而，已有的細胞膜特異性熒光聲色團（如 DiO、DiI、CellMask 等）都有一些缺點，比如發射波長短、斯托克斯位移小（Stokes shift，指最大熒光發射波長與最大吸收波長之間的差）、制備原液含有害的有機溶劑、需要較長的染色時間 (incubation period) 以及繁瑣的染色后清洗操作，特別是后兩者一直是細胞熒光成像領域長期未解的難題：

　　1.長時間的染色不僅費時，更經常會導致細胞組分的非特異性發光。

　　2.另一方面，染色之后殘留的熒光探針分子依然能發出較強的熒光；為了提升細胞圖像的信噪比，就需要在染色后將殘留的熒光探針洗去。然而，這種洗脫過程不僅繁瑣，而且容易改變細胞的周圍環境并在清洗過程中造成細胞的丟失，更不能滿足對生物過程進行連續監測的要求。

　　由此可見，能克服上述缺陷的新型細胞質膜熒光探針的開發，具有非常迫切的現實意義。

▲ 細胞膜熒光顯像示意圖 Source: Invitrogen

　　本篇論文

　　本文中首次報道了一種具有聚集誘導發光 (AIE) 特性的、最大發射波長在近紅外區波段 (NIR) 的水溶性 AIE 生色團 (AIEgen) 的設計與合成工作。此 AIEgen 被命名為 TTVP，可以特異性地以細胞膜為靶標進行快速的『熒光染色』，無需洗脫操作即可清晰成像。此外，在可見光的照射下，TTVP 成功實現了癌細胞的光動力殺滅。

　　合成與表征

　　在本文報道的工作中，研究人員設計的 TVP 和 TTVP 這兩個分子都是 D-A 型的化合物，其中 D 代表電子給體單元，A 代表電子受體單元。兩者的合成路線如下圖所示。

▲ TVP 和 TTVP 分子的合成與設計思路

　　這兩個分子均包含三苯胺片段（作為 D）或 / 和噻吩片段（作為 D 和 π-橋）、碳-碳雙鍵（π 橋）和吡啶鹽片段（作為 A）。在這兩個結構中，電子給體-受體 (D-A) 間有著強烈的相互作用，加上延伸后的 π 共軛體系，從而促進了分子內的電荷轉移，因此實現了更低的電子帶隙以及更長的吸收和發射波長。

▲ TVP 和 TTVP 分子的 HOMO 和 LUMO 軌道

　　通過將電子供體-受體（D-A）結構片段和親水性片段組合成螺旋槳形狀的分子結構，就可以得到水溶性的 NIR AIE 生色團（TTVP 分子）。得益于親水性的吡啶鹽與銨鹽片段，TVP 和 TTVP 分子都具有很好的水溶性。

　　這兩個分子在純的水溶液中幾乎不發光，這是因為分子中存在著許多可以自由旋轉的基團；這些基團的自由旋轉以非輻射的形式消耗了激發態的能量，因此不發光。

　　在水和四氫呋喃 (THF) 的混合溶液中，隨著 THF 比例的增加，TVP 和 TTVP 逐漸聚集并形成納米尺度的聚集體，而溶液受激發后發出的熒光也隨之逐漸增強。這是因為在聚集狀態下，上述單鍵的自由旋轉受到了限制；同時，三苯胺片段的扭曲構像進一步增加了分子間的距離，抑制了通過分子間 π-π 相互作用導致的熒光淬滅。

(c) THF/H?O 中不同 THF 比例所對應的聚集誘導熒光強度 (d) THF/H?O 中形成的納米尺度聚集體粒徑分布與電鏡圖像 (TTVP)

　　當 THF 的比例高達 90% 時，熒光強度也達到了最強。TVP 和 TTVP 兩者的最大吸收波長則分別為 467 nm 和 480 nm，而兩者在聚集狀態下的最大熒光發射波長分別為 629 nm 和 708 nm（分別處在紅光 / 近紅外波段的附近），表現出較大的斯托克斯位移。

(a) TVP 和 TTVP 的吸收光譜 (e) TVP和 TTVP 的光致發光 (PL) 光譜

　　生物成像應用

　　研究人員使用人宮頸癌細胞系 (HeLa cells) 進行了 TTVP AIEgen 的細胞膜的實際成像研究。作為水溶性的 NIR AIEgen，TTVP 在水溶液環境下不發射熒光（處于 off 狀態），因此未染色細胞膜的殘留 TTVP 幾乎不會構成背景干擾。

　　不同條件下的成像效果如下圖所示，細胞質膜成像非常清晰（與背景的對比度很高），而且在 10 min、5 min、2 min、30 s、3 s 的『染色』時長下，以及在脫洗或不脫洗的情況下，成像結果都沒有明顯的差異。

▲ 用 TTVP 染色 HeLa 細胞后的共聚焦顯微鏡圖像（TTVP 染色液濃度 500nM，λex= 488 nm，1% 激光功率）

　　有理由相信，TTVP 染色細胞膜的能力源于其所帶的正電荷以及所具有的兩親性：其上的正電荷使其通過靜電相互作用與細胞膜結合（特別是通常帶負電的癌細胞細胞膜）；由于良好的親水性，TTVP 在短時間內也不會穿透磷脂雙層的疏水區域。另一方面， TTVP 的疏水性發光部分被嵌入到低極性低的疏水區域中，其上單鍵的轉動受到限制，滿足了 AIE 過程對分子內旋轉受限的要求，從而在受到光照后就能發射出熒光。

▲ TTVP 作用下的 HeLa 細胞膜熒光成像：原理示意圖

　　受到以上成功的鼓舞，本文作者將這種超快染色和無洗滌操作的 TTVP 細胞膜成像方法進一步拓展到了其它的細胞系中，包括 293T cells、HCC827 cells、HCT116 cells 和 MDCK2 cells。在所有的例子中，細胞膜的成像效果都令人滿意：非常高的信噪比和非常強烈的紅色熒光）。

▲ 其它類型細胞的細胞質膜成像

　　光動力治療上的應用

　　光動力治療 (photodynamic therapy, PDT) 是一種溫和的癌癥治療方法，對正常組織的創傷性極小且可精確控制，現已被批準用于臨床。相比于紫外線，可見光對生物體系的傷害也更小。另一方面，先前報道過的各種細胞質膜熒光染料基本上只能用作成像探針，而不能同時實現成像和治療的雙重應用。

▲ 兩種 Ru 化合物及其在 PDT 中的應用 Chem. Sci., 2018, 9, 502-512（南京工大趙強、黃維，中南民族大學李襄宏等）

　　鑒于 TTVP 在可見光區域的強烈吸收，所以可以考慮以可見光為激發光源，依托 TTVP 生成 ROS（活性氧物種，會對細胞造成傷害）的過程進行 PDT。

　　實驗時，研究人員利用指示劑 H2DCF-DA 來測量的 TTVP 受光照后的 ROS 生成效率。如下圖 a 所示，無光照，TTVP 和 H2DCF-DA 單獨存在是熒光發射極弱。相反，在 TTVP 存在的情況下，H2DCF-DA 的熒光發射強度隨著白光光照時間的增加而逐漸增強，在 60 秒內增長了 87 倍。

(a) 不同照射時間后的 H2DCF-DA 發射熒光強度，表明了 TTVP 可在光照下產生 ROS；(b) 不同照射時間后的細胞活性測試結果，表明了 TTVP 被光照后所產生的 ROS 可對癌細胞進行殺滅

　　研究人員利用細胞存活率分析手段 (MTT assay)，在 HeLa 細胞上進行了定量評估，表明了 TTVP 在 PDT 應用上的巨大潛力。在 500 nM 的 TTVP 濃度下，HeLa 細胞的活性在光照 10 min 后迅速下降至最初的 15%；在 1 μM 的 TTVP 濃度下，白光照射后 HeLa 細胞幾乎完全死亡（上圖 b）。與之形成鮮明對比的是，在黑暗條件下，HeLa 細胞在 1 μM TTVP存在條件下依然保持 90% 的活性。

　　體內成像與細胞毒性試驗

　　如下圖所示，在小鼠的 HeLa 腫瘤內注射了 TTVP 水溶液后可以得到非常清晰的腫瘤成像。為了評估TTVP的腫瘤滯留潛力，注射后連續實時成像觀察，注射后 24 小時，腫瘤熒光圖像依然清晰可辨，表明 TTVP 在腫瘤細胞中具備優異的滯留能力；一般水溶性熒光小分子會很快被代謝排出，本文報道的水溶性TTVP 可以持久穩定地嵌入在腫瘤細胞的細胞膜種，有利于提高其腫瘤滯留能力，有望用于活體腫瘤的持久成像和治療。

▲ 應用體內成像與細胞毒性試驗（器官顯像與組織切片）

　　此外，瘤內注射 TTVP 24 h 后，H＆E 染色（蘇木精-伊紅染色）后的器官切片圖像顯示，小鼠的主要器官并沒有出現明顯的病理學改變，沒有出現系統性毒性的跡象。

　　小結

　　最后，作者指出，該項研究為設計具有長發射波長的水溶性 AIEgens 提供了新的思路，推動了高效且易于操作的新型熒光生物探針的開發進程。這項研究結果還能幫助發展出更高效的光動力治療分子，不僅有利于腫瘤的治療，還能促進生物探針在光動力治療的應用。

　　唐本忠院士簡介:

唐本忠院士 香港科技大學

　　唐本忠，中國科學院院士，香港科技大學張鑒泉理學教授、化學系與生物醫學工程系講座教授，華南理工大學-香港科技大學聯合研究院院長。1957 年出生于湖北省潛江市；1982 年于華南理工大學獲學士學位，1985 年、1988 年先后獲日本京都大學碩士、博士學位；曾在多倫多大學從事博士后研究工作。1994 年加盟香港科技大學，2009 年增選為中國科學院院士，2013 年入選英國皇家化學會 Fellow，2015 年在華南理工大學人體組織功能重建國家工程技術研究中心支持下獲批香港分中心，并任主任一職。現為科技部 973 計劃項目首席科學家、國家自然科學基金基礎科學研究中心項目負責人、廣東省引進創新科研團隊帶頭人、華南理工大學發光材料與器件國家重點實驗室學術委員會主任，以及中國化學會和英國皇家化學會聯合期刊 Materials Chemistry Frontiers 主編。

　　唐本忠院士主要從事高分子化學和光電功能材料研究，在聚集誘導發光 (Aggregation -Induced Emission, AIE) 這一化學和材料前沿領域取得了原創性和引領性的研究成果。作為 AIE 概念的提出者和研究的引領者，唐本忠教授累計發表學術論文約 1000 篇，引用 50000 余次，h-指數為 112，并于 2014-2017 年連續入選化學和材料雙領域高被引用科學家。

　　同時，唐本忠教授先后獲得多項榮譽及獎勵，如國家自然科學一等獎（2017，第一完成人）、何梁何利科學與技術進步獎（2017）、第 27 屆夸瑞茲密國際科學獎（2014）、美國化學會高分子學術報告獎（2012）、國家自然科學二等獎（2007，第四完成人）、裘槎高級研究成就獎（2007）、中國化學會高分子基礎研究王葆仁獎（2007）和愛思唯爾出版社馮新德聚合物獎（2007）等。

　　本文第一作者為香港科技大學、深圳大學 AIE 研究中心 王東 博士。