默克Amnis量化成像流式細胞儀在納米藥物研究中的應用

　　ImageStream技術建立在傳統的流式細胞術基礎之上，結合了熒光顯微成像技術，它具有多個檢測通道，可以對通過流動室中的每個細胞進行成像，實現了對細胞圖像進行多參數量化分析，獲得全新的細胞形態統計學數據。ImageStream系統配有功能強大的數據分析軟件IDEAS，可以對每個細胞分析超過500種量化參數。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。從2005年開始，Amnis量化成像流式分析儀被廣泛應用于生物化學、藥物研發、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、干細胞、毒理、病毒等各個領域。隨著ImageStream高速顯微成像流式細胞技術的發展成熟，越來越多的科研人員開始將這種革命性的技術手段運用到自身的研究領域，并發表了大量有影響力的論文。

　　圖1. 默克Amnis量化成像流式細胞儀

　　納米技術對多項高新技術的產生和發展都產生了極為深遠的影響，特別是在藥物研發領域。納米技術對于藥物研發的影響主要體現在：第一，革新藥物生產過程，改善生產工藝，降低成本提高效率；第二，顯著提升藥物的作用效果和靶向性，在改善治療效果的同時降低藥物毒副作用對機體的影響。例如，納米藥物載體能調節釋藥速度，改變藥物在體內的分布；提高藥物溶解度和生物利用度；使藥物準確到達靶向部位，減少藥物毒副作用。另據報道，納米藥物載體能使中藥的靶向性得到數百萬倍的提高，從而更精準地到達病變區域，產生更好的治療效果。納米藥物因其巨大的發展前景，受到各國的高度重視。

　　美國已有超過20種納米藥物進入各期臨床實驗。而我國也已啟動納米973計劃，目標直指具有自主知識產權的納米新藥。時至今日納米藥物的研究已經成為現代醫學發展和藥物創新的重要方向，在預防與控制癌癥等重大疾病研究領域都有望取得重要突破，極有可能在不遠的將來釋放巨大的經濟和社會效益。

　　納米藥物雖然是具有巨大發展前景的新型藥物，但由于發展的時間很短，納米藥物的基礎理論及納米級制劑的生產工藝等還很不完善，特別是納米藥物在臨床應用中的生物機制，以及納米藥物作用的細胞模型都非常欠缺，亟需發展。納米毒理學，納米藥物動力學，納米藥物結構優化和功能測定都亟需具備高通量和高內涵性能的新型細胞學水平研究工具。量化成像分析流式細胞儀以其高通量的數據獲取能力和量化成像分析能力很好地滿足了納米藥物的研究需求，為許多已經發表重要的高水平工作提供了關鍵性的數據，引起業內同行的高度重視。

　　量化成像流式細胞儀對納米材料的研究主要有兩種方式。一種是通過衡量納米藥物在細胞內部的熒光來判斷納米藥物在細胞內的攝入程度，即內化值，內化值越大，表示細胞內部攝入的納米藥物越多；第二種是通過計算細胞內部所攝入的納米藥物熒光點的數目來衡量納米藥物的攝入程度。

　　圖2. 分析納米顆粒是否進入細胞的兩種方法，一是通過內化參數Internalization來實現的，它代表的是外源信號在細胞以內存在的情況。該參數能夠在單個細胞以及整個細胞群體水平衡量納米載體或納米顆粒進入細胞的程度。二是統計細胞內的納米顆粒數量，是通過計點參數，即Spot Count Feature來完成。能夠統計在每個細胞范圍內，有多少個納米顆粒形成的小點，能反映納米顆粒進入細胞的效率。

　　近期發表在Acta Biomaterialia的文獻“A high-throughput bioimaging study to assess the impact of chitosanbased nanoparticle degradation on DNA delivery performance”一文綜合運用Amnis成像流式細胞儀對基于三甲基殼聚糖 (TMC)的納米顆粒（NPs）的生物學特性進行了研究。研究者們對基于三甲基殼聚糖的納米顆粒(TMC-NPs)研究了不同程度（從4%-21%不等）的乙酰化修飾，發現14%的乙酰化修飾可使納米顆粒的轉染效率最高。在這篇文獻中，研究者綜合運用Amnis成像流式研究了1：TMC-NPs進入細胞的內化時間曲線；2：對每個時間點進入細胞的納米顆粒數目進行自動統計；3：研究了納米藥物進入細胞內的位置定位；4：納米藥物對細胞造成的凋亡。這篇文章對于做納米藥物的研究者提供了有力的證據，利用Imagestream成像流式可以大大增加納米藥物的研發能力。

　　圖3.通過成像流式研究內化的時間曲線。(a)使用ImageStream獲取的明場視野下、YOYO-1（pDNA）和疊加的細胞圖像（標尺：10 um）。面罩分別用來計算全細胞（1），細胞質（2），和細胞膜（3=1-2）。YOYO-1圖像來代表在細胞質的區域，來區分內化的納米顆粒和位于細胞膜上的納米顆粒。(b)與CH(原始殼聚糖)或TMC-NPs孵育0.5-24小時后的YOYO-1陽性的ND7/23細胞比例。顯示出有NPs的細胞與內化了NPs的細胞的差別；（c）從0.5-24小時，NPs的時間曲線顯示出內化值的升高。

　　圖4：每個細胞的納米粒子囊泡 (NLV) 數隨孵育時間的量化。（a）從成像流式細胞儀 （明場）觀察到細胞中越來越多的 NLV (YOYO-1：綠色；標尺：10 um)。（b） 直方圖 NLV 頻數分布圖。被認為低 (c)、 中等 (d) 和高 (e) NLV的數目的細胞的比例。（f） 24小時的NPs NLV 數目的分布表。

　　圖5.在細胞核附近出現納米粒子囊泡 (NLV)的細胞百分比的測定。（a） 獲得的成像流式細胞儀的圖像。使用 480-560 nm (YOYO-1：綠色) 和 660-740 nm 的熒光通道采集 (DRAQ5-紅色) (標尺：10 um)。（b）選擇雙陽性細胞圈門；（c）YOYO-1與細胞核共定位的計算；（d）與 CH或TMC-NPs 孵化24 小時后細胞核附近NLV 陽性細胞百分比。

　　圖6.ND7/23 與 CH 或 TMC-NPs孵育后的細胞凋亡。（a）非凋亡和凋亡細胞圈門，以及代表圖像：明場和核區域 (DRAQ：紅色熒光) (標尺：10um)；（b） 細胞凋亡的百分比。