2018年5月CRISPR／Cas最新研究進展

　　基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統。

　　即將過去的5月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

　　1.Cell:開發出基于CRISPR的方法研究lncRNA的功能

　　doi:10.1016/j.cell.2018.03.052

　　如今，在一項開創性的研究中，來自美國貝絲以色列女執事醫學中心等研究機構的研究人員開發出一種新方法來鑒定和確定lncRNA在急性髓細胞白血病（AML）對化療藥物產生耐藥性中所起的功能作用。這種新技術將來自公開可獲得的藥理學數據庫的信息與前沿的CRISPR技術相結合，篩選影響治療反應的編碼基因和非編碼基因。總而言之，這種全基因組篩查平臺可用于鑒定和確定與許多健康情況相關的lncRNA的功能。相關研究結果發表在2018年4月19日的Cell期刊上，論文標題為“An Integrated Genome-wide CRISPRa approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance”。論文通信作者為貝絲以色列女執事醫學中心的Pier Paolo Pandolfi教授。

圖片來自Cell, doi:10.1016/j.cell.2018.03.052

　　Pandolfi和同事們著重關注控制阿糖胞苷（Cytarabine, Ara-C）耐藥性的遺傳學特征。阿糖胞苷是治療AML的一種金標準化療藥物，然而30%～50%的AML患者會產生耐藥性。在這項多步驟研究的第一階段，這些研究人員將來自兩個公開可獲得的數據庫---癌癥靶點發現與開發（Cancer Target Discovery and Development）數據庫和癌細胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia）數據庫---的信息進行交叉參考，以便鑒定出似乎與760種不同的細胞系對阿糖胞苷的敏感性和耐藥性相關的基因。

　　為此，Pandolfi和同事們將生物信息學研究工作轉移到體內測試。他們進行基于CRISPR的高通量篩選，以便獨立地評估哪些基因可能決定著阿糖胞苷耐藥性。這種CRISPR技術允許這些研究人員一次分析成千上萬個編碼基因和lncRNA，并可激活感興趣的基因。這些研究人員隨后利用阿糖胞苷處理細胞來觀察這些基因如何作出反應。基因富集的喪失表明它在藥物敏感性中發揮作用； 增強的基因富集意味著它介導耐藥性。

　　2.Sci Rep：科學家利用基因編輯技術治療艾滋病

　　doi:10.1038/s41598-018-26190-1

　　CRISPR/Cas9系統為編輯HIV-1病毒基因組提供了一種新的有潛力的工具，近日來自日本神戶大學醫學院感染疾病中心及健康科學研究生院國際衛生系的研究人員設計了一種RNA引導的CRISPR/Cas9以靶向HIV-1調節基因tat和rev，其中的引導RNAs（gRNA）都基于CRISPR的特異性設計，其靶向的序列在6種主要的HIV-1亞型中都保守存在。

　　在共轉染前每個gRNA都被克隆進CRISPRv2慢病毒中，從而創造了慢病毒載體并將之轉導進入細胞。和沒有轉染以及轉染空載體的細胞相比，CRISPR/Cas9轉染穩定表達Tat和Rev的293

　　T和HeLa細胞后，細胞中的這兩個基因表達都被成功的抑制。

　　Tat功能試驗顯示轉染tat-CRISPR顯著抑制了HIV-1啟動子驅動的熒光素酶的表達，而Rev功能試驗則顯示轉染rev-CRISPR后gp120的表達被完全抑制。Cas9剪切位點的靶基因出現高頻的各種程度的突變。值得注意的是，研究人員沒有檢測到任何非靶標靶位點出現突變，同時Cas9的表達對細胞的活性沒有影響。

　　研究人員進一步在HIV-1感染的T細胞系中測試了他們的CRISPR/Cas9系統，結果發現就算進行細胞因子再刺激，p24的表達也被顯著抑制，而同時使用6種gRNAs可以進一步增強編輯效率。因此利用CRISPR/Cas9系統靶向HIV-1調節基因也許是一種實現功能性治愈的有效方法。

　　3.Cell Rep：單次注射特殊制劑有望終生治療B型血友病患者

　　doi:10.1016/j.celrep.2018.03.121

　　對于大多數B型血友病（hemophilia B）的患者而言，其機體無法正常形成血凝塊，因此這些患者需要終生持續注射凝血因子來抑制疾病；如今來自索爾克研究所的研究人員通過研究表明，僅需要一次注射含有無病肝細胞的制劑就能產生小鼠所缺失的凝血因子，從而就能有效終生治療患B型血友病的小鼠，相關研究刊登于國際雜志Cell Reports上，同時本文研究結果還能極大地改變科學家們診斷B型血友病的手段，并有望開發治療B型血友病等其它遺傳性障礙的新型療法。

　　編碼凝血因子IX (FIX)的基因出現缺失就會誘發B型血友病，血友病患者機體中凝血因子IX的水平通常較低，而且常會缺失功能性的基因版本，從而就會造成危及生命的血凝延遲狀況；如今臨床上常常使用由動物細胞制造并且純化的FIX來給患者接種有效其病情，患者每周需要接種數次，但這種治療手段比較昂貴、耗時，而且隨著時間延續治療效果將會越來越差。

　　本文研究中，研究人員開發了一種新方法，利用能夠編碼FIX基因的信使RNA來治療工程化修飾患上B型血友病的小鼠，然而就像標準治療一樣，小鼠需要重復注射，而每次注射的信使RNA的劑量都非常小，因此科學家們就想嘗試一種持久性的方法，即將能產生FIX的健康肝臟細胞移植到患者機體中。

　　研究者Suvasini Ramaswamy表示，這種基于細胞的方法的吸引力在于我們可以盡量減少患者需要治療的次數，相比持續注射而言，我們可以一擊命中。由于捐贈的肝臟通常都是短缺的，因此研究人員轉向利用干細胞策略來產生健康的肝臟細胞，他們從兩名嚴重B型血友病的患者機體中收集了血液樣本(這些患者無法產生FIX)，隨后在實驗室中研究人員對這些細胞進行重編程使其成為誘導多能干細胞（ipsCs），而這些細胞就能夠轉化成為任何類型的細胞（包括肝細胞等），利用CRISPR/Cas9技術，研究人員就能修復每一位患者機體中的FIX基因突變，最終，研究人員就能誘導這些修復的細胞發育成為肝細胞樣的前體細胞（HLCs），并將這些細胞移植到B型血友病患者機體中。

　　相比對血友病小鼠進行手術而言，研究人員能通過脾臟對HLCs進行移植，并將細胞均勻分布在肝臟中。這種新型的HLCs不僅能夠產生FIX，而且其還能產生足夠的蛋白質使得小鼠機體形成正常的血凝過程，同時這些細胞還能在移植后至少存活一年。對于血友病患者而言，利用其自身的細胞來產生健康的HLCs，隨后再移植回患者機體中，就能有效避免患者出現的免疫排斥反應，但后期研究人員還需要進行更多的深入的研究才能將這種新技術轉向臨床試驗階段。

　　4.Nat Cell Biol：利用干細胞技術與基因編輯技術建立人類基因組功能藍圖

　　doi:10.1038/s41556-018-0088-1

　　最近，來自耶路撒冷的Hebrew大學的研究者們利用基因編輯技術以及人源胚胎干細胞技術繪制出了人類基因組的藍圖，揭示了基因對人體健康以及疾病發生的作用。相關結果發表在最近一期的《Nature Cell Biology》雜志上。

　　研究者們通過生成180000種不同的突變，對人類基因組中的所有基因功能進行了分析。其中，他們構建出了一種僅存在一對染色體的新型胚胎干細胞，并使用了CRISPR-CAS9技術進行大規模突變體的篩選。由于單倍體的特征，基因突變的構建相比野生型細胞更加容易。 研究者們發現，9%的基因對于胚胎干細胞的生長以及發育具有重要的意義，其中5%能夠限制細胞的生長。此外，作者還分析了對胚胎干細胞早期生長發育有關的基因。另外一些引發癌癥的基因也能夠影響人胚胎的生長。

　　另一方面，這項研究還鑒定得到了一類對于胚胎干細胞具有特異性作用的基因簇。這些基因被認為參與維持了胚胎干細胞的性狀，避免其癌化或分化形成成體細胞。

　　5.Blood：成功應用CRISPR/Case9進行體內HSPC基因編輯——重新激活成年小鼠紅細胞的γ球蛋白表達

　　doi:10.1182/blood-2018-03-838540

　　涉及β球蛋白基因突變的疾病，主要包括β地中海貧血和鐮刀型細胞病，代表了造血干/祖細胞（HSPC）基因療法的主要靶點。上述基因療法包括在成人CD34+細胞中用CRISPR/Case9介導基因編輯以重新激活紅細胞內的胎兒γ球蛋白表達。

　　由于CD34+細胞紅系分化的模型用于評估γ球蛋白再激活存在一定局限性，Chang Li等人建立人類β球蛋白位點的轉基因小鼠（β-YAC）。研究人員利用一種輔助依賴性的靶向人類CD46的病毒載體，表達CRISPR/Case9（HDAd-HBG-CRISPR）來破壞γ球蛋白啟動子區的抑制子結合區。研究人員在β-YAC/hCD46轉基因小鼠體內轉導HSPCs，然后將其移植到放射處理過的受體。

　　此外，研究人員還應用了一種體內HSPC轉導方法，包括動員HSPC和靜脈注射HDAd-HBG-CRISPR到β-YAC/hCD46轉基因小鼠體內。在兩種模型中，研究人員證實有效破壞目標位點可導致在成年小鼠紅細胞內，人類β球蛋白表達明顯變化γ球蛋白表達，而且該變化在第二次移植HSPCs后仍可維持。

　　在長時間的隨訪研究中，研究人員未檢測到血液學異常，提示HBG啟動子編輯不會負性影響造血功能。本研究是首個成功應用CRISPR/Case9進行體內HSPC基因編輯的研究。

　　6.Stem Cell Res：從患有非綜合征性CLN3相關視網膜變性患者中成功建立誘導性多能干細胞系

　　doi:10.1016/j.scr.2018.04.014

　　澳大利亞大學眼科與視覺科學中心的Zhang X近日在Stem Cell Res發表了一篇文章，他們建立了人源晚發性非綜合征視網膜色素變性的iPSC細胞系LEIi004-A。

　　該患者是由CLN3基因中雜合突變引起的晚發性非綜合征視網膜色素變性，研究者從患者獲取細胞，進行誘導培養后獲得人類iPSC細胞系，命名為LEIi004-A。他們使用含有OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和針對p53的shRNA，以及mir302 / 367等microRNA的質粒轉染細胞，對患者來源的原代真皮成纖維細胞進行重編程。他們還構建了對照的細胞系。具體操作是使用CRISPR / Cas9基因編輯的方法，在患者來源的iPSC細胞中糾正一個CLN3的突變，獲得了iPSC細胞系，命名為LEIi004-A-1。

　　7.Ophthalmology：利用CRISPR有望治療遺傳性眼疾

　　doi:10.1016/j.ophtha.2018.04.001

　　在一項新的研究中，Stephen H. Tsang博士及其同事們發現使用兩個向導RNA（gRNA）可將清除缺陷基因的效率從30%提高到90%。他們將這種基因組編輯技術與基因置換技術相結合，利用腺相關病毒將健康的基因導入視網膜中。他們采用客觀的視力測試評估小鼠治療后的視網膜功能，結果顯示得到顯著改善。

　　8.Blood：亞等位基因Rag1突變可在淋巴細胞早期發育階段影響其免疫功能

　　doi:10.1182/blood-2017-12-820985

　　在遲發性聯合免疫缺陷的肉芽腫和（或）自身免疫（CID-GAI）和外周T細胞和B細胞功能異常的患者中，發現了允許殘存的T細胞和B細胞發育的亞等位基因RAG1突變。為檢測亞等位基因Rag1突變是如何影響淋巴細胞發育的最初期階段，Lisa M. Ott de Bruin等人利用CRISPR/Case9技術建立攜帶與CID-G/AI患者中發現的相同突變的小鼠模型，其研究結果于近日發表在Blood雜志上。

　　免疫學特征顯示T/B淋巴細胞部分發育、存在幼稚細胞和血清免疫球蛋白，但抗體反應受損，而且存在自身抗體，良好的模擬了CID-G/AI患者的表型。

　　通過高通量測序發現，早期祖細胞的Igh V和Trb V基因的應用存在顯著偏移，在分選后對生產性Igh和Trb重排存在偏差，B細胞祖細胞凋亡增加。Igk位點重排受損，而且可檢測到多反應性IgM抗體。

　　總而言之，本研究為我們理解亞等位基因Rag1突變如何改變T/B淋巴細胞的主要功能提供新的見解，從而為經常在患者中看到的免疫失調奠定理論基礎。