納米孔測序技術發展簡介

　　隨著對DNA結構和序列的研究，DNA測序技術不斷發展，成為生命科學研究的核心領域，對生物、化學、電學、生命科學、醫學等領域的技術發展起到巨大的推動作用。利用納米孔研究出新型的快速、準確、低成本、高精度及高通量的DNA測序技術是后人類基因組計劃的熱點之一。

　　納米孔測序技術發展簡介

　　納米孔檢測技術作為一個新型平臺，具有低成本、高通量、非標記等優勢，可將基因組測序的成本降低到1000美元以下。一些國內外團隊積極參與這項研究，尤其是牛津納米孔公司的Bayley小組首次研發了商用DNA測序設備。納米孔檢測技術有利于促進生命科學的發展，為個體化醫療帶來革命，并將人類疾病臨床診斷及治療帶入新的時代。

　　納米孔分析技術起源于Coulter計數器的發明以及單通道電流的記錄技術。生理與醫學諾貝爾獎獲得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片鉗技術測量膜電勢，研究膜蛋白及離子通道，推動了納米孔測序技術的實際應用進程。1996年，Kasianowicz 等提出了利用α-溶血素對DNA測序的新設想，是生物納米孔單分子測序的里程碑標志。隨后，MspA孔蛋白、噬菌體Phi29連接器等生物納米孔的研究報道，豐富了納米孔分析技術的研究。Li等在2001年開啟了固態納米孔研究的新時代。經過十幾年的發展，固態納米孔技術日益發展成熟。

　　納米孔的基本工作原理：在充滿電解液的腔內，帶有納米級小孔的絕緣防滲膜將腔體分成2個小室，如圖1，當電壓作用于電解液室，離子或其他小分子物質可穿過小孔，形成穩定的可檢測的離子電流。掌握納米孔的尺寸和表面特性、施加的電壓及溶液條件，可檢測不同類型的生物分子。

　　由于組成DNA的四種堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子結構及體積大小均不同，單鏈DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脫氧核糖核苷酸分子，當單個堿基在電場驅使下通過納米級的小孔時，不同堿基的化學性質差異導致穿越納米孔時引起的電流的變化幅度不同，從而得到所測DNA的序列信息。

　　目前用于DNA測序的納米孔有兩類：生物納米孔(由某種蛋白質分子鑲崁在磷脂膜上組成)和固態納米孔(包括各種硅基材料、SiNx、碳納米管、石墨烯、玻璃納米管等)。DNA鏈的直徑非常小(雙鏈DNA直徑約為2nm，單鏈DNA直徑約為1nm)，對所采用的納米孔的尺寸要求較苛刻。

　　生物納米孔

　　生物納米孔是天然的生物納米器件，具有特定的孔徑結構、生物活性及能夠插入脂雙分子層膜的能力，由于可進行靈活的化學或生物修飾而受到科學家的青睞。

　　α-溶血素(αHL)納米孔

　　αHL是目前最廣泛使用的生物納米孔的分析物質，由293個氨基酸多肽構成，可插入到純凈的雙分子層脂膜中形成蘑菇狀七聚體，組裝成跨膜通道。αHL七聚體納米孔主要由帽型區(Cap，入口cis端直徑為2.6nm)、邊緣區(Rim，直徑為1.4nm)和主干區 (Stem，入口trans端直徑為2.2nm)三部分構成。αHL 納米孔永久開通不關閉，耐強酸和強堿，高溫、高電壓下較穩定。

　　1996年，Branton小組第一次演示當電流驅使單鏈DNA穿過鑲嵌在磷脂雙分子層上的α-溶血素蛋白時會使電流瞬時下降，證明納米孔蛋白可以用于DNA的檢測。隨后Kasianowicz等采用α-溶血素蛋白納米孔對單鏈DNA、單鏈RNA易位行為進行研究，提出利用α-溶血素納米孔實現快速、廉價的DNA測序的設想，是生物納米孔單分子檢測研究的里程碑標志。

　　英國牛津大學Bayley教授將α-溶血素與核酸酶結合后，利用氨基化環糊精配體固定，將待測核酸上的堿基按順序剪切后在電場的作用下有序地通過蛋白質納米孔，使其可以選擇性識別四種堿基。英國牛津納米孔技術公司 (Oxford Nanopore Technologies)成功將該研究成果用于核酸測序。

　　近期，Schneider小組結合電壓控制技術、phi29 聚合酶和α-溶血素納米孔建立了一個新的測序平臺，利用phi29聚合酶將雙鏈DNA解旋，使其中一條單鏈穿過鑲嵌在磷脂雙分子層中的α-溶血素納米孔，通過電流的變化，獲得DNA的序列信息。phi29 聚合酶的解旋速度可相應降低DNA在納米孔中的遷移速度，有利于捕獲更為準確的序列信息。

　　MspA納米孔

　　恥垢分枝桿菌中的孔蛋白(Mycobacterium smegmatis porinA，MspA)是適合研究DNA測序的另一個納米孔蛋白。呈圓錐狀，八聚體孔蛋白，有一個寬約1.2nm，長約0.6nm的短窄的收縮區。與5nm長的α-溶血素蛋白孔相比，更有利于對單堿基的測定。Gundlach教授首次報道將核酸末端連接核酸分子夾，利用MspA納米孔識別四個單堿基的技術，可減緩DNA的穿越速度，提高DNA單堿基的檢測靈敏度。

　　固態納米孔

　　固態納米孔主要是在氮化硅、二氧化硅和石墨烯等絕緣材料上用離子刻蝕技術、電子刻蝕技術、聚焦電子束(FEB)或離子束(FIB)等制作出的微小孔洞。

　　目前固態納米孔的制備，首先用常規微加工技術制作30～500nm厚的懸空薄膜，再用離子束或電子束等在硅或其他材料薄膜表面鉆出2～100nm的孔洞。DNA檢測中所需的納米孔直徑都是1～2nm，可在前述研究的基礎上，進一步采用沉淀物質收縮、離子束輻射、電子束輻射等收縮技術減小納米孔的尺寸，從而達到更小目標尺寸的納米孔。

　　哈佛大學Li等在2001年首次報道了使用離子刻蝕技術在Si3N4薄膜上制作出了直徑61nm的孔，同時利用氬離子束輻射使納米孔收縮到1.8nm。開啟了固態納米孔制備和研究的新時代，使固態納米孔技術日益成熟，豐富了納米孔單分子檢測技術研究。

　　近十幾年來，由于固態納米孔具有穩定及耐用等特點，越來越受到科學家的青睞，制作固態納米孔的技術、設備和材料的不斷更新，使其研究有著突飛猛進的發展。

　　利用納米孔技術對DNA進行測序，要真正實現商業化應用，還面臨著嚴峻的挑戰，需要科學家進一步探索，如提高通道的選擇性和靈敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。除DNA測序外，納米孔的無需標記、無需放大的單分子檢測技術還可以在RNA檢測、蛋白質檢測等各種重大疾病的生物標志物檢測方面得到應用。相信隨著納米孔技術的深入研究，以及各項科學技術的結合使用，將使其在化學、物理學、生物學、電子學和醫藥學中的應用更加廣泛，對生命奧秘的探索、疾病的治療，以及整個生命科學的發展起到巨大的推動作用。