酶聯免疫分析技術在食品檢驗中的應用

　　摘 要：目的：以大米為例研究分析酶聯免疫分析技術在食品檢驗中的應用。方法：選取適量的大米檢驗混合樣本，稱量樣品重量并在樣品中加入適量的甲醇溶液，充分搖勻，過濾出提取物，同時加入適量的蒸餾水進行稀釋，利用酶聯免疫分析術進行檢驗，觀察檢驗結果。結果：應用酶聯免疫分析技術可有效測試出大米中所含有的黃曲霉毒素B1（AFTB1）等。結論：從本文的研究結果可以看出，酶聯免疫分析技術在實際的食品檢驗中具有重要的應用價值，值得進行廣泛推廣。 
　　黃曲霉毒素屬于一種產毒菌株的代謝物，這種代謝物并不屬于單一的化合物，從另一個角度來說，其在結構上與化合物有著某種相似性，但是與化合物之間還是有著明顯的不同。這種物質是引發癌癥的主要物質之一，其所具有的毒素為肝臟毒素，如果被人體所吸收，就會對人的健康造成嚴重的影響。由于其所具有的毒性以及危害性較大，所以，對其進行嚴密的檢測就顯得尤為必要。而這種毒素可能會存在于大米等食物中，利用酶聯免疫分析技術來對其進行檢測，可有效的降低檢測的誤差值，使得檢測的結果更加的精確，下面就對這種檢測方法在測定大米中AFTB1的實際應用效果進行深入的研究分析。 
　　1.實驗部分 
　　1.1儀器和設備 
　　小型粉碎機；內徑為0.995mm的分樣篩；分析天平；濾紙；微量移液器及配套吸頭；培養箱；黃曲霉測定儀；酶聯免疫測試盒。 
　　1.2酶聯免疫測試盒組成 
　　① 包被抗體的聚苯乙烯微量反應板24孔。② A試劑：稀釋液，甲醇：蒸餾水為7：93（V/V）。③B試劑：AFTB1標準物質溶液，1.00 。④C試劑：酶標AFTB1抗原（AFTB1---辣根過氧化物酶交聯物，AFTB1-HRP）；AFTB1：HRP（摩爾比）<2：1。⑤D試劑：酶標AFTB1抗原稀釋液，含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PH7.5磷酸鹽緩沖液的配制：稱取3.01克磷酸氫二鈉，0.25克磷酸二氫鈉，8.76克氯化鈉加水溶解至1升。⑥ E試劑：洗滌母液，含0.05%吐溫-20的PBS溶液。⑦F試劑：底物液a，四甲基聯苯胺（TMB），用PH5.0乙酸鈉----檸檬酸緩沖液配成濃度0.2克/升。PH5.0乙酸鈉---檸檬酸緩沖液的配制：稱取15.09克乙酸鈉，1.56克檸檬酸加水溶解至1升。⑧G試劑：底物液b，1毫升PH5.0乙酸鈉---檸檬酸緩沖液中加入0.3%過氧化氫溶液28微升。⑨ H試劑：終止液，C=2摩爾/升的硫酸溶液。 
　　1.3試驗試劑的配制 
　　1.3.1選取兩種試劑，并標注為C、D。在C試劑中，適當的進入一些D試劑，試劑的容量在1.5ml范圍內，充分搖勻，制成酶標AFTB1抗原溶液，用作試驗試劑，留存于冰箱中冷藏保存。 
　　1.3.2E試劑中加入300毫升蒸餾水配成實驗用洗滌液。 
　　1.3.3甲醇水溶液：甲醇：水為5：5（V/V） 
　　1.4樣品的處理 
　　分別稱取5.0克樣品于4個100毫升具塞三角瓶中，準確加入25.0毫升甲醇水溶液，于3～4號三角瓶中加入1ug/ml的標準溶液50微升，振搖15分鐘，過濾，棄去1/4初濾液，收集式樣濾液。分別取樣液0.5毫升與4個10毫升比色管中加入1.5毫升A試劑將樣品提取液進行稀釋，搖勻。此液為樣品待測液。 
　　1.5實驗步驟 
　　1.5.1試劑平衡：將測試盒于室溫放置15分鐘以上，平衡至室溫。 
　　1.5.2小孔編號：根據實驗需要截取相應孔數放置反應板框架上。設定1號孔為儀器調零孔，2～7號孔為AFTB1標準對照孔.8～11號孔為樣品孔。 
　　1.5. 3 洗滌：每孔加入250微升洗滌液，洗滌液不得溢出，放置1分鐘后甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗板一次。 
　　1.5.4依次加入配制好的溶液及待測樣液。 
　　第一步：1號孔加入50微升A試劑，2～7號孔分別加入系列的B試劑（AFTB1標準容液：0，0.1，0.25，0.5，1.0，2.0ng/ml）50微升，其余各孔加入相應的待測樣液50微升。 
　　第二步：1號孔加入50微升D試劑（酶標抗原稀釋液）其余各孔均加入50微升C試劑（酶標抗原稀釋液）。 
　　第三步：輕輕的振搖，使各孔的反應物混勻。 
　　1.5.5反應：將反應板放入37度恒溫培養箱中孵育30分鐘。 
　　1.5.6顯色，每孔分別加入F試劑（顯色底物液a）和G試劑（顯色底物液b）各50微升，搖勻，將反應板放入37℃恒溫培養箱中顯色15分鐘。 
　　1.5.7終止與儀器測定：每孔分別加入H試劑50微升，用酶標測定儀在450nm波長處測定各孔的吸光度A值。如下表： 
　　2.結果 
　　2.1計算公式 
　　AFTB1含量（ng/g）=C×V/M×D 
　　式中，C：待測樣液中AFTB1含量（ng/ml） 
　　V：樣品提取液體積（ml） 
　　M：樣品質量（g） 
　　D：樣品稀釋倍數 
　　2.2含量計算 
　　查數據，經反對數計算可知 C8=C9=0ng/ml C10= 0.436ng/ml C11= 0.458ng/ml 
　　10號樣品中AFTB1含量（ng/g）=0.436× 25/5×4=8.72 
　　11號樣品中AFTB1含量（ng/g）=0.458×25/5×4 = 9.16 
　　平均值 =（8.72+9.16）/2=8.96（ng/g） 
　　2.3回收率計算 
　　⑴加入AFTB1量 1ug/ml×50ul=50ng 
　　⑵回收率=（8.96×5-0）/50 ×100% =89.6% 　　3、討論 
　　由試驗結果可知，在對AFTB1進行測定的過程中，應用酶聯免疫分析技術可以有效的減少相應的檢驗步驟，使得檢驗步驟更加的簡便，同時也能夠提高檢驗的精確性，而且由于該技術自身所具有的高靈敏度以及特異性，使得其檢驗的誤差相對較小，在實際的食品檢驗中，其是一種值得被廣泛推廣的檢驗技術。 
　　在目前的免疫檢測方法中，酶聯免疫分析法應用較為普遍，這種方法在實際的應用中，主要是利用抗原抗體反應所具有的特性與酶對底物所產生的催化作用所結合，從而進行物質的檢測。顯示的結果主要是通過酶作用后底物所出現的顏色變化來辨別。一般來說，這種檢測方法主要是應用酶標測定儀來進行檢測結果的測定，其具有較強的敏感度分析能力，其敏感度最佳可以達到ng水平，隨著酶聯免疫分析技術的發展，其應用的領域逐漸拓展，在目前的食品檢測中，酶聯免疫分析技術的應用越來越廣泛，在食品的其他檢測領域中，酶聯免疫分析技術也有著一定的應用作用。 
　　例如，在檢測食品的農藥殘留中，很多的國際權威機構都已經認識到了酶聯免疫分析技術的應用優勢，并將其應用在食品中農藥殘留的檢驗中，并且將其作為主要的檢驗方法來應用，甚至在很多的西方發達國家中，還在此檢驗技術的基礎上，研制出了新型的商品檢驗試劑盒，并將其應用到食品農藥殘留的檢驗中。而酶聯免疫分析技術主要能夠檢測出食品中所含有的除草劑、殺菌劑以及殺蟲劑等農藥的殘余。再例如，在檢測食品中的微生物方面，在過往的微生物檢驗中，主要依靠的是手工操作，不僅會使得檢驗的時間過程，也會使得檢驗的精確度下降，而采用酶聯免疫分析技術這種方法對食品中所含有的微生物進行檢驗，酶聯免疫分析技術所具有的敏感性以及特異性會高達97%以上，甚至達到了100%。除此之外，這種檢驗方法不會受到來自食品提取樣品中存在的各種成分的干擾，檢驗的結果具有較高的準確性，并且這種檢驗方法可以有效的縮短檢驗的時間，最短2天就可以得出檢驗結果。