食品微生物檢驗之紙片法

　　摘要：紙片法在食品檢測的實際應用中表現出操作簡便、靈敏度高、速度快等特點，為食品檢測技術的發展提供了有力的技術支持。本文主要介紹了紙片法的原理和紙片法在食品中微生物檢測中的方法應用以及與平板計數法進行了對比研究。 
　　前言： 
　　食品安全問題越來越受到人們的重視，微生物對食品的污染問題也相應地備受關注。在食品生產、加工、儲存、運輸、銷售等各個環節中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質，或導致食源性感染和食物中毒，食品的檢測與分析工作已經提高到一個極其重要的地位。特別是為了保證食品的標準品質，開展食品科學技術研究，尋找食品污染的根源，人們更需要對食品進行各種有效營養物質和對人體有害、有毒物質的檢驗和分析。自20世紀70年代起，各種食品檢測不斷出現，主要包生物化學技術、紙片法等，目前這些技術在食品檢測和分析等方面已經得到了較好的應用，特別是紙片法。紙片法以其操作簡便、靈敏度高、速度快等優勢在食品檢測領域得到愈來愈廣泛的應用[1，2]。 
　　一、紙片法的原理 
　　紙片法，即以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定微生物的方法[3]。快速測試片法有以濾紙為載體的測試片，這種測試片是一種水合物干膜，由上下兩層薄膜組成，上層是聚丙烯薄膜，下層是上印有網格的聚乙烯薄膜，通過一種冷水可溶性的凝膠劑附著在培養基上。培養基上有微生物生長所需的營養物質、特異性顯色物質和抗生素。 
　　紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成一種濃度梯度。在藥物擴散的同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的測試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。不同抗菌藥物抑菌圈的直徑因受藥物在瓊脂中的擴散速率的影響而可能不同，抑菌圈的大小可反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關，即抑菌圈越大，MIC越小。 
　　二、紙片法的優、缺點及改進 
　　本文介紹的是北京陸橋公司研制的Easy TestTM紙片（簡稱ET），E T微生物測試紙片是一種將脫水培養基附著于無紡布棉墊上的即用型檢測產品，利用了特異性酶與特異性顯色底物反應的原理，使目標菌與非目標菌呈現可明顯區別的不同特異性顏色，ET測試紙片的培養載體采用了無紡布和水溶性營養底物的設計，具有良好的吸水性，可快速吸收測試液，使微生物自動均勻分布于無紡布上，為測試液和營養底物創造了一個固定的混合區域。這種紙片法排除了濾紙測試片不易計數、營養物質分布不均、顯色指示劑單一和保水性差的缺點，待測樣品不需滅菌、本身帶有培養基，樣品可直接加入。其特點可歸納為：可應用于現行GB/T 4789-2008和SN標準中；使用方便，即用型產品，省去配制步驟，減少工作量；大量縮短檢測時間，提高檢測效率；降低對操作人員的技術要求；準確：靈敏度高、特異性強；可用于食品微生物檢測和環境衛生檢測，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數、金黃色葡萄球菌計數。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡便、快速、省料，特異性和敏感性與發酵法符合率高，使用時應正確掌握操作技術和判斷標準，從而達到理想的檢測效果[4]。 
　　從實用性來說，ET紙片省卻了大量的玻璃器皿的麻煩，操作簡便，攜帶方便，污染小；可在野外迅速檢測所采集樣本，避免常規方法因運輸時間長而造成的菌落環境變化，更能反映采集樣本真實菌落情況；培養后所長的為有色菌落，便于計數。 
　　紙片法也有其弊端，測試片較小，菌量數較大時計數困難；只研制出了少數幾種類型的測試片，只能局限于幾個指標的檢測上。 
　　目前，對紙片法分改進主要是擴大被檢測目標菌種種類；研制具有檢測較大菌量的紙片，并且提高檢測準確性。神保勝彥[5]（1991）對紙片法作了進一步研究和改進，改進后的紙片法不僅能夠確定抗生素的種類，而且提高了檢出率和準確性，氯霉素最低檢出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，鏈霉素1mg/kg，紅霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。 
　　三、紙片法在食品微生物檢驗中的應用[6] 
　　1.菌落總數測試片，揭起覆蓋的膠片，將1ml樣品懸液滴于紙片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養基上。靜置約1min使培養基中的凝膠固化。測試片水平放于37℃恒溫箱內培養。細菌總數測試片培養48±3h后計數紅色菌落數作為細菌總數，亦可用作乳酸菌測定。 
　　2.霉菌、酵母菌測試片，該測試片含霉菌酵母生長的營養物質、菌落生長的指示劑，并添加抗生素以抑制細菌生長。接種后，21℃～25℃培養3～5 d，計數。酵母菌菌落特征：小型菌落，邊緣清晰，顏色均一，灰白色至藍綠色，菌落隆起。霉菌菌落特征：大型菌落，邊緣模糊，中間顏色深暗，顏色不均一，菌落扁平。 
　　3.大腸菌群、大腸桿菌檢測紙片，該測試片含有改良的VRB（Violet Red Bile）培養基及葡萄糖苷酸酶指示劑。絕大多數大腸桿菌能產生β-葡萄糖苷酸酶，與培養基中的指示劑反應，產生藍色沉淀環繞在大腸桿菌菌落周圍，表面覆蓋的膠膜，可留住發酵乳糖產生的氣體，形成藍色和深藍色的菌落并有氣泡相連。大腸菌群菌落在測試片上產酸，pH指示劑使培養基變為暗紅色，在紅色菌落周圍有氣泡者為大腸菌群。所以，一次測試即可測出大腸桿菌和大腸菌群數：帶氣泡的藍色和紅色菌落為大腸菌群，帶氣泡的藍色菌落為大腸桿菌。 
　　4.金黃色葡萄球菌測試片，該測試片含有改良的Baird Parker培養基，對于金黃色葡萄球菌的生長有很強的選擇性，并能將其鑒定出來，與3個Baird Parker平板加一個血漿凝固酶試管的方法等效。其可形成暗紫色菌落，如果在測試片上有其它可疑菌落出現，可以使用金黃色葡萄球菌確認反應片。其含有顯色劑及脫氧核糖核酸，由于金黃色葡萄球菌產生的脫氧核糖核酸酶，具有耐高溫特性，高溫處理后仍能將DNA降解而與反應片上的顯色劑反應形成粉紅色環。 　　5.沙門氏菌測試片，將選擇性培養基中加入沙門氏菌特有辛酯酶的顯色指示劑，并將其加載在紙片上，通過培養，如果樣品中含有沙門氏菌，即可在紙片上呈紫紅色的菌落。 
　　四、分別用紙片法和平板計數法檢驗食品中的大腸菌群 
　　1.檢驗之前的準備，檢驗之前的準備是保證檢驗高質量的前提，應做好以下幾點： 
　　1.1為了保證微生物檢驗的高質量，要求檢驗人員的要有專業知識和熟練的技術，而且還必須具備對工作的高度責任感和實事求是的科學工作作風。確保實驗室人員得到及時培訓及不斷更新知識，學習和掌握新理論、新技術和新方法。 
　　1.2 環境，實驗室應具有進行微生物檢驗適宜充分的設施條件，包括檢測設施（專用于微生物檢測和相關活動）及輔助設施（大門、走廊、管理區、樣品區、清潔間）特殊的設備要在特殊的環境下放置和操作。所用無菌實驗室應符合GB19489[7]的規定。 
　　1.3 操作，操作人員必須嚴格按照GB/T 
　　4789[8]食品微生物檢驗標準中的操作規程進行檢驗，做好滅菌處理，為防止二次污染采取必要措施，原始記錄要真實準確，不得隨意填寫。按照GB/T 4789標準規定的方法進行數據處理及結果判定。 
　　以嚴謹科學態度，做好上述幾個環節準備工作，就能使我們微生物檢驗數據的準確性得以保證，為食品衛生和安全提供可靠技術保障。 
　　2.材料與試劑 
　　2.1 材料：培養箱、移液器、水浴鍋等。 
　　2.2 試劑與培養基：北京陸橋大腸菌群ET測試紙片，培養基。 
　　2.3 茵株：大腸桿菌標準菌株一株，金黃色葡萄球菌標準菌株一株，實驗室分離保存菌株兩株（沙門氏菌和酵母菌）。 
　　2.4 樣品：瓶裝啤酒、冰點、休閑小食品、糕點、速凍食品、水產品、乳制品、熟肉制品等為本實驗室日常抽檢樣品和委托檢驗樣品，生肉類、熟制品、涼拌菜共十二類產品，每類10份樣品，共120份樣品。 
　　3.比較與實驗方法 
　　3.1 方法比較：根據實際試驗操作情況，將GB方法（平板計數法）[9]同ET測試紙片法進行對比，主要列舉和分析計數原理、操作步驟、培養時間等。 
　　3.2 檢測結果比較實驗 
　　3.2.1 菌株加標實驗：將大腸桿菌、沙門氏菌和酵母菌分別和干擾菌金黃色葡萄球菌一起加入各類食品樣品中，每類加入3份，共36份樣品。每份樣品目標污染值約為1*10CFU/ML，每份樣品均采用GB平板計數法VRBA法和北京陸橋大腸菌群測試紙片ET法同時檢驗。 
　　3.2.2 普通樣品檢測：將120份樣品按照GB4789.3—2010處理，用平板計數法VRBA法和ET測試紙片法同時檢驗。 
　　3.2.3 結果分析：將加標實驗的36個結果和普通樣品檢測中的陽性結果取對數，進行配對t檢驗，計算P值，研究兩種方法間是否存在顯著性差異[10]。 
　　4.結果與分析 
　　4.1 方法比較，針對GB4789. 3—平板計數VRBA法與ET測試法的比較見表1。 
　　4.2 菌株加標實驗結果：加標的36個樣品結果見表2。 
　　4.3 普通樣品檢測結果：十二類120個樣品中，共檢出59對陽性結果，具體結果見表3。 
　　4.4 通過配對t檢驗計算可知P值為0.16 > 0.05，可見兩種方法檢測結果無差異。 
　　4.5紙片法與平板計數法相比較，具有快速、簡便、易于操作等特點[11]，平板計數法需要72h出結果，而紙片法只需24h就能報告檢測結果，檢測速度得到了很大的提高，更能滿足現代食品進出口業務快進快出的要求，而且紙片法操作簡便，省去了培養基配制、殺菌消毒、器皿洗滌等繁瑣的勞作，有效提高了實驗室的工作效率，但是測試片價格較貴，可先在專業食品檢測實驗室和經濟效益較好的食品生產企業推廣使用。 
　　五、結論 
　　盡管食品微生物的檢測方法有很多種，但紙片法在食品檢測的實際應用中表現出操作簡便、靈敏度高、速度快等特點，已在食品領域的微生物檢測中得到廣泛應用。隨著紙片法食品微生物檢測技術的不但發展，相信紙片法會在食品微生物檢測、監控等方面發揮愈來愈大的作用。 
　　參考文獻： 
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　　[2] 吳清平.周艷紅.蔡芷荷.衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用[J].中國衛生檢驗雜志.2005. 
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　　[4] 王芳.王凱.樊赟.劉沛.王磊.Easy Test（TM）測試片——微生物快速檢測新產品.《食品安全導刊》.2010. 
　　[5] 神保勝彥.孟惠英.蜂蜜中殘留四環素類和磺胺類藥物的微生物簡易檢測法.《農業新技術新方法譯叢》.1993. 
　　[6] 王會娟.王麗.路琳等.實驗室常用的微生物快速檢驗技術.[J].肉類工業.2004. 
　　[7] 《實驗室生物安全通用要求》.GB19489- 
　　2008. 
　　[8] 微生物檢測標準.2010. 
　　[9] GB 4789.3-2010.食品安全國家標準.食品微生物學檢驗大腸菌群計數. 
　　[10] 鄭建淮.陳曉燕.毛文軍.復方醋酸環丙孕酮和羅格列酮序貫用藥對氯米芬抵抗的多囊卵巢綜合征患者內分泌及生育功能的影響.2005. 
　　[11] 林彩華.許如蘇.曾梅錦等.SN標準和紙片法檢測水產品衛生指標菌的比較.[J]中國衛生檢驗雜志. 2006.