案例分析：CD19CART治療后T細胞過度活化和增殖

　　嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)修飾的T細胞治療在治療血液腫瘤領域取得令人欣喜的治療效果，尤其是抗CD19 CART細胞在治療B細胞惡性腫瘤患者時顯著提高了其臨床結局。抗CD19和抗CD20 CART在治療復發難治性B細胞急性淋巴細胞白血病B-ALL和非霍奇金淋巴瘤NHL的臨床試驗中已廣泛開展，并顯示出了一定的有效性。然而，CART治療過程中，患者也出現了一些不良反應，如細胞因子釋放綜合征CRS，對于靶脫瘤毒性、神經毒性和腫瘤溶解綜合征TLS，需要謹慎處理。隨著CART治療患者的增加，一些潛在的毒性也逐漸顯現。

　　在一個臨床研究(NCT01864889)中，發現1例復發難治CD19+彌漫大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)患者接受CD19 CART治療后，體內T細胞過度活化和增殖。輸注后13天，外周血中淋巴細胞數達到77×109/L，CD8+活化T細胞占淋巴細胞的比例達到93.06%。患者出現了發熱和缺氧，血清中細胞因子、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、谷草轉氨酶等水平顯著升高。基于臨床數據和實驗室數據，排除了T細胞白血病，未發現過度T細胞增殖是CD19抗原依賴的。

　　通過對該患者T細胞受體TCR的高通量測序和全基因組測序發現，TCR具有多樣性，但并沒有與T細胞增殖有關的特異的基因突變。另外，該患者有JC病毒(John Cunningham polyomavirus，JCV)感染。因為病毒誘導的非特異型號可以調節細胞周期，不能排除JC病毒感染通過旁路途徑對免疫系統的激活，導致T細胞過度活化和增殖。在進行CART治療時應事先考慮細胞輸注后在體內不受控制地活化和增殖的風險，提前制定相應的風險控制措施，對該患者的分析將有助于同類產品臨床試驗安全性風險的控制。

　　案例信息

　　這是一名29歲的亞洲男性，接受CART治療前7個月被診斷為CD19+DLBCL IIIB期，接受了6個周期的治療，包括2個周期的R-CHOP，2個周期的R-EPOCH，1個周期的R-GDP，以及1個周期的Hyper-CVAD，均未獲得完全緩解。納入CART臨床試驗前，進行了FDG-PET/CT掃描，顯示右腋下病灶的淋巴瘤進展。最大病灶約為4×5 cm，SUVmax是23，其他身體區域未發現病灶。白細胞計數正常，WBC 5.58×109/L，淋巴細胞20.1%，中性粒細胞72.4%，骨髓未受累。采集該患者的外周血單核細胞PBMC，進行CD19 CART的生產。CD19 CART的激活域是CD3ζ，共刺激域是CD137(41BB)，采用慢病毒載體。在環磷酰胺(30 mg/kg，共3天)和氟達拉濱(25 mg/m2，共3天)預處理后，患者分3天接受了CD19CART(總劑量為2.53×106個/kg)。轉染效率是74.5%。

　　輸注后患者較為耐受，未立即出現毒性。但在輸注后第8天，外周血中CD19+B細胞顯著下降，伴隨著CAR拷貝數顯著升高。輸注后1周，B超檢測發現，病灶減小至1 cm。輸注后3周CT掃描與基線相比，病灶幾乎消失。

　　毒性

　　CART細胞輸注后7天出現不良事件，包括發熱(39.3℃)、寒戰、皮疹。血清中一些細胞因子和C反應蛋白CRP水平迅速升高，包括顆粒酶A、顆粒酶B、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IFN-γ、IFN-β。實驗室生化檢測結果顯示，輸注后第9天，乳酸脫氫酶LDH和AST水平顯著升高。ALT和γ-GT的峰值出現在第14天，考慮該患者發生了CRS，因此，給予了妥珠單抗(8 mg/kg，用藥1天)和甲強龍(2 mg/kg，用藥3天)。第11天，患者體溫恢復正常，患者的轉氨酶水平逐漸下降，CRS得到控制。第18天，患者體溫低2次達到峰值，IL-6、IFN-γ、CRP水平升高，再次給予妥珠單抗(8 mg/kg，用藥1天)。

　　然而，出人意料的是，第13天，淋巴細胞計數迅速升高到77×109/L。流式細胞儀結果顯示93.06%的淋巴細胞是CD3+和CD8+T細胞，CD8+CD28+T細胞占淋巴細胞比例從18%升高到90%，CD4+T細胞比例下降到非常低的水平，NK細胞(CD16+CD56+)幾乎消失。分泌IFN-γ和顆粒酶的CD3+CD8+IFN-γ+和CD3+CD8+GrB+ 細胞高于基線水平。第17天，患者血氧過低，第18天，患者出現彌漫性肺滲出。皮疹的病理結果顯示真皮層有T細胞，為避免白細胞淤積，第13和14天給予患者小劑量環磷酰胺(10 mg/kg)進行治療，隨后，白細胞計數逐漸下降。第34天，淋巴細胞計數又開始升高，因此又給予環磷酰胺(10 mg/kg，2天)，環磷酰胺劑量較小，不會誘導粒細胞缺乏。輸注后第12天，患者的中性粒計數幾乎為0，意味著患者粒缺將近20天。由于淋巴細胞迅速增殖，對粒細胞增殖造成抑制。第38天，由于患者出現寒戰和高熱，進行了血培養檢測。培養3天后，發現了亞胺培南抵抗的不動桿菌屬的鮑曼不動桿菌，雖然使用了多種抗生素的聯合治療，患者最終由于敗血性休克死亡。

　　輸注后1天，對外周血和單核細胞的形態學分析結果初步顯示，大量的未成熟淋巴細胞，90%是有核細胞。流式細胞儀分析結果顯示，T細胞受體并非單一克隆，而是多樣的。為確認TCR的多樣性，進行了深度測序，結果顯示樣本中含有11030個不同克隆，另外，13個克隆比例占到1%以上，然而，無優勢克隆或T細胞克隆，核型分析也未發現T細胞急性淋巴細胞白血病，因此，T-ALL引起的T細胞過度增殖可以被排除。

　　為進一步分析T細胞過度增殖的原因，進行了二代深度測序，結果也未發現T細胞增殖相關的突變。通過實時定量PCR檢測，發現有病毒DNA，且是JC病毒陽性。該病毒在免疫功能不全的人體內會再激活，引起嚴重致命的反應。

　　討論

　　T細胞存活受到T細胞受體TCR、共刺激分子(包括CD28)、黏附分子、細胞因子(如IL-2、IL-13、IL-15)、其他凋亡因子、抗凋亡因子的影響。在CAR+T細胞中，細胞的激活和增殖是特異抗原依賴的。在本文案例中，細胞輸注后4天，CD19+B細胞水平仍然較低。由于淋巴結病灶消失，無法進行活檢，也無從獲知淋巴結是否表達CD19，不能排除病灶中CD19抗原誘導的T細胞增殖，然而，這種可能性很小。

　　載體DNA整合到宿主細胞引起插入突變的風險較低，但是一旦發生十分危險。有文獻報道，在兩名年輕患者基因治療后3年，LMO2位點的插入突變引起T細胞不受控制的增殖，CD3+T細胞達到100×109/L。然而，本案例的一系列流式細胞儀結果、測序結果和核型分析結果排除了這一可能。

　　有報道稱，在病毒感染存在時，非特異和抗原特異刺激均能引起CD8+T細胞增殖。本案例中，檢測到JC病毒的存在。通過測序結果顯示，患者中CD8+T細胞不是JC病毒特異的。排除了病毒相關抗原引起的T細胞增殖。但病毒感染引起的旁路激活途徑不能忽視，T細胞可以被旁路激活途徑刺激增殖，例如病毒感染產生大量細胞因子產生和釋放，引起炎性微環境。體外實驗證明許多細胞因子可以刺激CD8+T細胞增殖，如TNF-α、IL-2、IFN-α/β、IL-12、IL-15、IL-18。該患者發生CRS時，許多細胞因子急劇升高，然而目前還沒有發生CRS的患者引起T細胞增殖的報道。

　　由于CART治療血液腫瘤療效顯著，多家醫院正在開展或將要開展該療法。除大家熟知的CRS、神經毒性等CART治療相關不良事件外，T細胞過度活化和增殖對患者的生命造成很大威脅。在使用該療法時應充分評估其安全性，做好相應的風險控制方案。