淺談MALDITOFMS在微生物鑒定和診斷中的應用

發布時間：2018-11-21 17:03 原文鏈接：淺談MALDITOFMS在微生物鑒定和診斷中的應用

前言

20世紀初，質譜技術作為一種分析技術，開始應用于化學科學領域，到20世紀90年代，基質輔助激光解析電離（Matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI）和電噴霧電離（Electrospray ionization, ESI）兩種軟電離技術的出現，使得質譜能夠對生物大分子進行微量分析。與ESI MS相比，MALDI生成的是單電荷離子，數據更易于分析，且在分析前無需色譜分離，因此具有高通量、快速、完全自動化的特點，廣泛用于蛋白質組學的研究中。

MALDI TOF MS通過對完整細胞或細胞提取物的分析完成微生物的鑒定，不僅具有快速、靈敏和經濟的特點，且在技術上易于被微生物學家接受，可用于許多目的，如微生物鑒定、菌株分型、流行病學研究、生物戰劑檢測、水和食源性病原體的檢測、抗生素耐藥性的檢測、血和尿道病原體檢測。這種方法的不足之處在于用于鑒定新的分離物時，圖譜數據庫中必須包含相應的屬/種/亞種/株的多肽指紋圖。

原理與方法

MALDI TOF MS 的基本原理是將樣品與過量的小分子基質的混合溶液點加在樣品的靶盤上，待溶劑揮發后形成共結晶，用激光照射晶體時，基質分子吸收能量與樣品解吸附并使其電離，通常是基質上的質子轉移到樣品分子上。采用不同的質量分析器，如四級桿質量分析器、離子肼分析器、飛行時間分析器等檢測帶電荷的分析物，從而獲得樣品的質量信息，微生物鑒定通常采用飛行時間分析器（time of flight）。

MALDI源產生的樣品離子根據t=const.(m/z)1/2(t為離子飛行時間，const為常數，m為離子質量，z為離子所帶電荷)，通過檢測飛行時間確定離子的質荷比，最后利用質荷比對樣品進行定性和定量。MALDI TOF MS 中最常用的是氮激光源，波長為337nm 。也有用紅外激光即鉺/鐿-鋁-石榴石（Erbium/yttrium-aluminium-garnet, Er-YAG）激光，波長為2.94um。

基于TOF獲得的分析物特征圖譜稱為多肽指紋圖（PMF）。MALDI用于微生物的鑒定時，或者將未知微生物的多肽質量指紋圖（peptide mass fingerprint, PMF）和數據庫中的指紋圖進行比對，或者將未知生物的質量生物標志分子與蛋白質組數據庫進行比對完成。

樣品準備

在樣品準備方面，不同的微生物需采用不同的樣品準備方法，樣品不做任何處理，直接涂到樣品板上，晾干后再點加基質溶液，或肉湯與基質溶液直接混合分析，但是只有選擇合適的基質和溶劑才能獲得有意義的圖譜；用于微生物全細胞裂解物或天然細胞提取物的分析時則需要進行樣品制備。

許多有機化合物可用作基質，但是用于微生物的鑒定，α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamicacid, CHCA），2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxy benzoicacid, DHB），和3,5-二甲基-4-羥基肉桂酸（3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, sinapinicacid）最為常用。

基質溶液包括水，有機溶劑的混合物如乙醇/甲醇、乙腈和強酸如三氟乙酸（TFA），能夠溶解基質。溶劑能夠穿透微生物的細胞壁，提取細胞內蛋白質。當溶劑揮發，蛋白質分子和基質溶液內的其他細胞化合物形成共結晶。

鑒定方面

應用MALDI TOF MS完成樣品分析時，對于微生物種水平的鑒定，典型的質量范圍為m/z 2-20kDa，主要是核糖體蛋白和一些看家蛋白。用于鑒定特定的微生物通常質量范圍為m/z 2-10kDa，獲得的結果與可擴展開放數據庫中包含的核糖體蛋白PMFs進行比對，可鑒定微生物到屬的水平，許多情況下甚至鑒定到種和株的水平。

由于這種方法比較簡單，微生物診斷實驗室容易開展此項工作，利用許多生物PMFs的商業數據庫，廣泛應用于微生物鑒定領域。由于創建預測蛋白質分子量的數據庫之前需要獲得生物的全基因組序列，微生物診斷實驗室很少采用比對生物標志物的質量與基因組序列預測的蛋白質的分子質量來完成微生物的鑒定。

數據庫系統

數據庫系統是MALDI平臺的關鍵組成部分，微生物專業數據庫的開發使得MALDI TOF MS成為非常有價值的微生物鑒定工具。第一代用于微生物鑒定的MALDI TOF MS系統是Bruker Daltonics開發的MALDI Biotyper。MALDI Biotyper包含基本的MALDI TOF 平臺、操作和分析軟件、數據庫和樣品提取/制備系統。軟件和數據庫易于與Bruker MALDI TOF儀器及相關的操作和分析軟件整合，且支持自建數據庫。

另外一個微生物鑒定MALDI平臺由Shimadzu與bioMérieux合作開發，Shimadzu提供儀器和分析軟件 “Launchpad”，而bioMérieux 提供和維護中心數據庫“SARAMIS”，可以升級。后來，Andromas 引進了一種不同于上述兩種類型的數據庫和軟件，其與Bruker和Shimadzu的儀器兼容，用于常規細菌鑒定。在MALDI TOF MS 發展過程中的一個里程碑事件是監管機構批準其可用于臨床細菌和真菌的常規鑒定。

在剛剛過去的幾年中，MALDI Biotyper CA 系統(Bruker Daltonics Inc.)經美國FDA批準用于人標本培養的細菌鑒定（體外診斷），而VITEKR MS (bioMerieux Inc.)也經美國FDA批準用于培養的細菌和酵母的鑒定。2012年，中國首次批準將MALDI TOF MS應用于臨床，國家FDA批準bioMérieux VITEK MS 系統用于體內診斷（invitro diagnostic）。后來，國家FDA也批準Bruker IVD MALDI Biotyper用于人標本分離到的微生物的常規鑒定。

總結

商業化MALDI 平臺的生物數據庫系統包含的微生物種類非常多，幾乎包含了所有代表性的微生物，使得結果具有可比性，假陽性率極低。有些基于MALDI的鑒定研究中，出現不能鑒定的情況，原因可能是早期的數據庫中不包含這些生物，而不是方法學錯誤。

遺憾的是，由于這些數據庫和軟件的價格太高限制了個體研究者的使用。而現在有研究者開發出開放性的數據庫和軟件，有mMASS，Mass-Up，pkDACLASS，MALDIquant，SpectraBank，BioSPLEAN等等，可免費用于科學領域，部分彌補了此缺憾。

相信隨著更多數據庫和軟件系統的開發、完善和升級，MALDI TOF MS將成為微生物鑒定領域非常重要的技術工具和手段。