MALDITOFMS在病原微生物鑒定中的研究進展

       基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術是近年來發展起來的一種軟電離新型有機質譜，通過引入基質分子，使待測分子不產生碎片，解決了非揮發性和熱不穩定性生物大分子解吸離子化的問題。2002 年，諾貝爾化學獎獲得者美國科學家約翰·芬恩、日本科學家田中耕一和瑞士科學家庫爾特·維特里希發明了對生物大分子進行識別和結構分析的方法。芬恩和田中開發出了對生物大分子進行質譜分析的“軟解吸附作用電離法”，維特里希則開發出了用來確定溶液中生物大分子三維結構的核磁共振技術。這些研究成果已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質的強有力工具，被廣泛應用于生物技術和制藥企業的藥物開發、化學物質和生物病原體的監測等。MALDITOF-MS 具有靈敏度高、準確度高、分辨率高、圖譜簡明、質量范圍廣及速度快等特點，在測定生物大分子和合成高聚物應用方面有特殊的優越性。

       在MALDI-TOF-MS 的多種應用中，基于細菌表面蛋白分子量檢測的MALDI-TOF-MS 技術是一種全新的微生物快速檢測和鑒定技術。通過測定細菌自身獨特的蛋白質組成，應用質譜技術將測得的蛋白質和多肽按分子量大小排列，形成獨特的蛋白質組指紋圖，通過特征性的模式峰進行菌株的鑒定。其基本原理為：將微生物與等量的基質分別點在加樣板上，溶劑揮發后形成樣品和基質的共晶體，基質從激光中吸收能量使樣品解吸，基質與樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，經過飛行時間檢測器，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來檢測離子的分子量，通過專用軟件分析比較，確定出特異性的指紋圖譜。圖1 為MALDI-TOF MS的基本原理示意圖。

       該技術不是基于微生物的生理生化指標和基因，而是根據各種微生物的蛋白質組表達譜的比較來進行的。每種微生物都有其區別于其他種類的獨特的蛋白質組成，因而擁有獨特的蛋白質指紋圖譜，這是由物種的遺傳特性所決定的，受外界環境條件等影響較小。因此，相對于其他常用的微生物檢驗技術，蛋白質組指紋圖譜更為準確和直接。目前，國內外學者已經在多種細菌的檢測和鑒定方面取得良好的效果。MALDI-TOF-MS 具有靈敏、準確和快速的特點，適合各種微生物進行高通量的快速檢測，為生命科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段。傳統細菌鑒定方法基于形態學、革蘭氏染色和生理生化特性分析，雖然結果準確、可靠，但一般需要數天時間才能完成，而且許多細菌鑒定程序十分繁瑣。近年來發展起來的PCR、熒光PCR 和核酸序列分析等分子生物學檢測技術在微生物鑒定方面雖然得到了一定的應用，但由于其敏感性高，容易出現假陽性，而且對近似種的細菌鑒定還存在一些不足。因此，對一些與人類健康關系密切的病原菌還需建立更加快速、準確、實用的檢測和鑒定方法。

1 MALDI-TOF-MS 技術在普通病原菌鑒定方面的應用

       在常見的人和動物病原菌檢測鑒定方面，MALDI-TOF-MS 技術已經在單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella sp.）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）、腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）及阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）等病原菌的快速鑒定方面進行應用，取得很好的結果。Veen 等對來自病人、并經傳統生化技術鑒定的327 個分離株進行MALDI-TOF-MS 測試，差異結果用16S 基因進行分析。該方法可以在基因水平正確鑒別95.1% 的菌株，在種的水平正確鑒別率為85.6% ；對980 株來自臨床的細菌和酵母菌株進行確認，總體上MALDI-TOF-MS 鑒定種的準確率明顯好于傳統的生化鑒定系統（分別為92.2% 和83.1%），錯誤率明顯較少（分別為0.1% 和1.6%）。MALDITOF-MS 對腸桿菌科、非發酵的革蘭氏陰性菌、葡萄球菌、混雜菌群和酵母菌的鑒定準確率分別達到97.7%、92%、84.8%、84% 和85.2%。試驗結果表明，MALDI-TOF-MS 在葡萄球菌的鑒定以及屬于混雜菌群的細菌種屬的鑒定方面明顯好于傳統的方法。

       在法國，對來自醫院的1013 個臨床樣品應用MALDI-TOF-MS 和傳統的表型細菌生物學方法進行鑒定，差異結果用16S rRNA和 / 或 rpoB 基因測序進行確認。當樣品未經純培養時，MALDI-TOF-MS 可以對其中的837 個樣品在種的水平進行正確鑒定；當樣品經過純培養后，可正確鑒定986 個樣品。相對的，表型方法只能鑒別945 個樣品。事實上，只有15% 的菌株必須先進行純培養。在屬的水平該結果更好，MALDI-TOF-MS 鑒別準確率可達99%，表型方法可達98%。對血液肉湯培養的細菌直接用MALDI-TOF-MS 進行鑒定，總共檢測了212 個菌株，分屬于32 屬60 種或群，并與生化試驗方法進行比較，差異用基因測序進行確認。162 株得到準確鑒定，42 株沒有結果，主要因為血液肉湯培養基中的細菌數量不足。另外，8 株鏈球菌（Streptococcus mitis）被誤診為肺炎鏈球菌。

       單增李斯特菌是導致人類李斯特菌病的一種食源性病原，也為孕婦的條件致病菌。對李斯特菌屬進行快速、準確的鑒定對及時干預和有效治療十分重要。國外學者應用MALDI-TOF-MS 測試了不同的李斯特菌和血清型，包括臨床分離株，不同李斯特菌的質譜圖具有特征性的峰值。該方法與脈沖場凝膠電泳方法測試的不同血清型的李斯特菌進行比較表明，MALDI-TOF-MS 可以有效鑒別李斯特菌及其亞型，甚至可以在種水平鑒定到單增李斯特菌的致病株。我國學者也報道了利用MALDI-TOF-MS鑒定單增李斯特菌的方法獲得很好的結果。

       脆弱擬桿菌及其相關的種是導致人類混合感染的重要病原，其不同的分離株表型較相似，生長速度較好氧菌慢得多，因此用傳統方法或自動表型鑒定方法常常出現誤診。應用MALDI-TOF-MS 對277個臨床細菌樣品中的脆弱擬桿菌進行鑒定，同時用傳統表型鑒定方法作為參考，對出現差異的以及MALDI-TOF-MS 不能鑒定的菌株采用16S rRNA 基因測序進行確認。結果其中的270 個樣品與MALDI Biotyper 數據庫中的參考菌株匹配分值大于2.0 ；23個與傳統表型方法結果不同的樣品中，11 個進行了測序。其中10 個樣品序列證實MALDI-TOF-MS 結果準確，剩下的菌株序列無法鑒定到種，只能到屬。表明MALDI-TOF-MS 比生化測試方法具有更高的鑒定能力和準確性。

       酵母和酵母樣真菌對人類的嚴重感染導致的臨床影響在不斷增加，尤其是免疫抑制病人。因此，對病原進行快速和可靠的鑒定對抗真菌治療十分重要。用MALDI-TOF-MS 對臨床分離的267 株酵母菌進行快速鑒定，包括Candida、Cryptococcus、Saccharomyces、Trichosporon、Geotrichum、Pichia 和Blastoschizomyces spp.。結果與傳統生化方法進行對照，MALDI-TOF-MS 方法對247 個臨床分離株可以鑒定出準確結果，未發現假陽性；而傳統的API生化鑒定方法在首輪只鑒定出244 個分離株。MALDI-TOF-MS 被證明是最快速和可靠的酵母和酵母樣真菌鑒定方法。

       奈瑟菌屬（Neisseria）包括對人類致病的腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌（N. gonorrhoeae）以及幾種非致病的種類。Elena 等應用MALDI-TOF-MS鑒定奈瑟菌屬的細菌，通過采集腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌以及其他非致病的奈瑟菌的試驗和臨床菌株的蛋白質譜，發現存在明顯的種間差異，而種內差異很小。群聚分析可以成功地區分腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌和非致病奈瑟菌。

       奶粉中的阪崎腸桿菌（也稱克羅諾桿菌）污染對幼兒具有嚴重的危害。我國趙貴明等應用MALDI-TOF-MS 與API 方法分別對32 株阪崎腸桿菌（28 株分離株，4 株參考菌株）與相近菌株陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌進行鑒定，并對鑒定結果分析比較。MALDI-TOF-MS 方法將32 株阪崎腸桿菌鑒定到種、屬水平分別為56.2% 和37.5%，API 方法為75%、21.9%。3 株菌未獲得鑒定結果，其余29 株菌的鑒定結果相符。通過對獲得的菌株蛋白質質量圖譜進行對比和聚類分析，可以將阪崎腸桿菌屬進一步劃分為不同類型，結果顯示4 株阪崎腸桿菌參考菌株質量圖譜約在5 740（m/z）離子質荷比處出現1個相近離子峰，28 株阪崎腸桿菌分離株中27 株（占96.4%）表現出相同結果。32 株阪崎腸桿菌被分為6種類型。因此，MALDI-TOF-MS 適合用于阪崎腸桿菌的鑒定，而且根據獲得的細菌蛋白質圖譜可將阪崎腸桿菌劃分為不同類型。楊捷琳等從嬰幼兒奶粉中分離得的阪崎腸桿菌，利用MALDI-TOF-MS測定得到了肽質量指紋圖譜，最終鑒定出阪崎腸桿菌中特異性蛋白，為進一步開展阪崎腸桿菌的毒力及致病性的研究打下基礎。

       梭菌屬細菌因不容易培養，鑒別和分類都比較困難。基于細菌的代謝特點的傳統方法需要嚴格的標準化的培養基和生長條件才能保證結果重現。雖然基于DNA 檢測的方法，如針對種特異性基因的PCR 方法，可以得到準確、可重復的結果，但事實上其有效性十分有限，因為在傳染病病例中毒素編碼基因并非必需。16S rDNA 測序技術被認為是梭菌分類的金標準，可以鑒定難以培養的細菌，但也是一項耗時且昂貴的技術。應用MALDI-TOF-MS 技術對31 種64 株梭菌進行鑒定，在數分種內即可準確鑒定為梭菌。一些傳統方法難以鑒別的梭菌如C.chauvoei 和C. septicum， 也能得到鑒定。因此，基于高質量參考數據庫的MALDI-TOF-MS 技術可以作為快速、準確鑒定梭菌的有效工具。

       此外，國外還有許多學者應用MALDI-TOF-MS技術對大腸埃希氏菌及大腸桿菌0157:H7、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等細菌進行鑒定，都取得良好的鑒定效果。

       MALDI-TOF-MS 技術以細菌表面蛋白為檢測對象，因細菌蛋白主要取決于細菌自身的遺傳因素，受培養基、培養時間以及其他培養條件等外部因素的影響較小，因而具有很好的穩定性和可重復性。其鑒定結果的準確性主要取決于數據庫中采用的參考菌株的蛋白指紋圖譜的準確性。因此，數據庫中的參考菌株種類和數量越多，采集的蛋白指紋圖譜越完善，得到的鑒定結果也越準確。應用MALDITOF-MS 出現的錯誤鑒別主要與其數據庫中缺乏來自合適參考菌株的充分的質譜圖有關。目前，傳統生化鑒定方法容易受細菌活力和濃度等因素的影響，所有樣品都需要先進行培養、單個菌落分離、再純化培養得到充分純化的菌株才可能鑒定出準確結果。而MALDI-TOF-MS 技術可以對一些醫院的臨床樣品中的致病菌培養后未經純化直接進行檢測和鑒定，大大節省了時間，可以及時對病人采取有效的治療措施。因此，應用MALDI-TOF-MS 技術研究和建立一些特殊病原菌的直接檢測方法，對許多醫院和微生物實驗室具有良好的發展前景。

2 MALDI-TOF-MS 技術在多血清型細菌鑒定領域的應用

       細菌不僅種類多，而且同一種細菌常常還有多種血清型，而不同血清型的細菌，其生理生化特性可能存在明顯的差異，尤其在對人類和動物的致病性方面可能完全不同。因此，如何對同一種細菌進行快速分型，是細菌鑒定的另一項重要課題。傳統的細菌培養和生化鑒定方法無法對沙門氏菌、大腸埃希氏菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌等多種與人類健康密切相關的多血清型病原菌進行分類，需要進一步采用血清學或噬菌體試驗等技術。目前，應用MALDI-TOF-MS 技術對這些多血清型細菌進行鑒定和分類得到了初步應用，在沙門氏菌分型中表現出較好的分型能力。

       沙門氏菌是嚴重危害動物和人類健康的傳染病病原。利用優化的MALDI-TOF-MS 試驗條件對來自病人糞便的88 株沙門氏菌進行檢測和分型，并與血清學分型、耐藥分型和PFGE 分型結果進行比較。在反映親緣關系的差異水平值為100 時，88 株沙門氏菌被分為15 個MALDI-TOF-MS 型別。MALDITOF-MS 分型結合耐藥表型分型，可以將88 株沙門菌分成44 個亞型；MALDI-TOF-MS 分型結合血清學分型，可以將88 株菌分成46 個亞型。MALDI-TOFMS分型結合PFGE 分型，可以將88 株菌分成64 個亞型。對遼寧省食源性疾病監測檢出的24 株沙門氏菌和2 株沙門氏菌標準菌株進行鑒定，并對其中4 種血清型的16 株沙門氏菌進行種水平的鑒定。結果分別在屬和種的水平上準確鑒定了沙門菌株，并且在種的鑒定水平上與血清分型結果具有極大相關性。可以區分屬于4 個種的4 株沙門氏菌的蛋白峰之間的微小差異。而且，對相同血清型的4 株腸炎沙門菌的聚類分析及主成分分析顯示出其同源程度的差異。因此，MALDI-TOF-MS 技術在沙門氏菌血清分型中表現出較好的分型能力，在屬水平上鑒定沙門氏菌具有很高的準確性，在種水平上的鑒定也有著很好的應用前景。

       雖然MALDI-TOF-MS 在沙門氏菌的血清分型中具有一定的分型能力，但其分型結果與傳統的血清分型結果還存在明顯的差異，可能因為MALDI-TOFMS主要依據細菌蛋白質組進行分類，而細菌的血清型并不完全取決于其蛋白組成。我們應用MALDITOF-MS 技術對不同血清型的霍亂弧菌、沙門氏菌和大腸桿菌進行檢測和分型也出現一些不理想的結果；一些同種、不同血清型的細菌的蛋白質譜圖十分相似，很難區分。目前，國內外在這方面的研究報告還很少，尚無法判定MALDI-TOF-MS 真正的血清分型能力。

3 MALDI-TOF-MS 技術在非發酵性細菌鑒定方面的應用

       發酵性細菌是指不能利用葡萄糖或僅能以氧化形式利用葡萄糖、專性需氧和無芽胞的革蘭氏陰性桿菌，主要包括假單胞菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬和產堿菌屬等，其中很多種類對人類為機會致病菌。近年來這一類類細菌從住院病人的痰、尿、血液和體液標本中的分離率日漸增高，其中假單胞菌屬的銅綠假單胞菌在肺部感染中十分重要，已成為引起院內感染的重要致病菌。非發酵性細菌在自然環境中大量存在，但因其有限的生化反應特性和不同的形態特征，傳統表型鑒定方法常常出現誤診。MALDI-TOF-MS 技術在鑒定非發酵性細菌方面已經表現出一定的優越性。

       Mellmann 采用MALDI-TOF-MS 檢測了37屬248 株非發酵的菌株，其中大部分與人體感染有關。按照儀器廠商的建議建立了基于MALDI-TOFMS的參考數據庫。為評估該數據庫，分析了80 株非發酵的臨床盲樣菌株。作為物種鑒定的參考方法，采用16S rRNA 部分序列測序的方法。通過16SrRNA 基因測序，80 菌株中的57 株具有可鑒別的特異的序列（ 同源性>99%）；11 株開始沒有明確的結果，只能鑒定到屬；10 株鑒定到屬（同源性>97%）；2 株同源性低于極限值被認為無法鑒定，從進一步分析名單中排除。MALDI-TOF-MS 鑒定了78株菌中的67 株（ 85.9%），與參考方法相一致。9 株鑒定錯誤，2 株無法鑒定。當使用3 種不同的質譜圖和4 種不同的培養基，10 株隨機選擇的菌株結果完全一致。因此，MALDI-TOF-MS 方法是一種準確、