MALDITOF在臨床微生物檢測中的應用

自從2015年美、中兩國陸續推出了“精準醫療計劃”后，“精準醫療”就一直備受社會各界的廣泛關注。臨床微生物檢驗在感染性疾病診斷、用藥指導、抗菌藥物管理、醫院感染控制等方面對實施精準醫療起著至關重要的作用。近年來，由于抗菌藥物的濫用導致多種細菌耐藥以及新型細菌的出現，使得目前臨床上對微生物種類的鑒定工作更加困難。 傳統的微生物鑒定基于革蘭氏染色和微生物代謝生化反應, 操作過程復雜，仍無法實現快速鑒定。因此，臨床微生物實驗室亟需新的檢驗技術，以滿足實施精準醫療的發展需求。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技術，是20世紀80年代末問世并于近年迅速發展起來的一種新型軟電離質譜技術，是目前分子定性能力最強的分析方法。將質譜法應用于微生物鑒定是微生物檢驗方法的一次技術性革命。與傳統的鑒定相比，簡化了鑒定流程，縮短了鑒定時間，具有準確、快速、靈敏及高通量等優點，并可對完整的病原菌細胞和臨床樣本進行直接檢測。

MALDI-TOF MS主要由三部分組成：基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）、飛行時間質量分析器（TOF）和檢測器。MALDI的原理：微量樣品與過量小分子基質在靶板上形成共結晶薄膜，基質通常為有機芳香弱酸，主要包括2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）等。不同的待測樣品要選擇不同的基質，通常蛋白質樣品采用CHCA或SA。當激光照射樣品與基質的共結晶時，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，同時將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離和氣化。這一技術適合于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據離子在飛行管內的飛行速度與離子的質荷比（m/z）成正比，不同m/z值的樣品到達檢測器的飛行時間不同，從而實現對質荷比不同的樣品分子的鑒定(見圖一)。MALDI-TOF MS鑒定微生物主要是通過檢測未知菌種獲得微生物的蛋白質譜圖，并將所得的譜圖與數據庫中的微生物參考譜圖比對后得出鑒定結果。 

圖一 MALDI-TOF MS的工作原理

目前市場上有三種商業MALDI-TOF系統可用于微生物鑒定：MALDI Biotyper系統（Bruker Daltonics，德國），Vitek MS系統（BioMérieux，法國）和Clin-TOF II系統（北京毅新博創生物科技有限公司，中國)。

眾多研究顯示，利用MALDI-TOF MS已經能鑒定出大部分細菌。革蘭陽性菌中葡萄球菌、腸球菌在種水平的鑒定準確率近乎100%，其他陽性菌如乳酸球菌、李斯特菌、棒狀桿菌等也能被質譜技術準確鑒定出來。革蘭陰性菌如腸桿菌、奈瑟菌、耶爾森菌和弧菌等的鑒定也都獲得了良好的結果。質譜技術還可用于分枝桿菌的鑒定。對1990-2015年國外公開發表的關于MALDI-TOF MS檢測分枝桿菌的文獻進行了薈萃評價后, 合并得出飛行質譜技術鑒定分枝桿菌屬的正確率為91%。這也顯示了MALDI-TOF MS對分枝桿菌屬的鑒定有較好的準確性。

另外，厭氧菌的鑒定在內源性感染性疾病中受到了廣泛的關注，目前只有少量的研究分析了MALDI技術在厭氧菌鑒定方面的應用，主要原因是數據庫中厭氧菌的參考譜圖還比較少。厭氧菌的前處理方法與普通細菌相同，由于多數厭氧菌生長速度較需氧菌慢，應適當延長培養時間。MALDI-TOF MS現已能實現對臨床常見厭氧菌及許多少見厭氧菌菌種（普雷沃菌、梭桿菌、梭菌、擬桿菌和革蘭陽性厭氧球菌等）的準確鑒定，并且結果優于傳統生化試驗方法。 2014年在一項對106份厭氧菌的研究中，MALDI-TOF與傳統技術的鑒定結果一致率可達95.3%。

在真菌鑒定方面，大部分文獻已報道MALDI-TOF MS可以用于常規酵母菌的監測，并發現該技術鑒定酵母菌的準確率達到85.2%。此外，質譜還可以準確地區分近平滑念珠菌、擬平滑念珠菌、似平滑念珠菌復合體以及鑒別新型隱球菌和格特隱球菌亞種。絲狀真菌由于所需培養時間長、傳統鑒定方法具有局限性，使用MALDI-TOF MS進行對其鑒定更能體現其優勢。絲狀真菌由于細胞壁難以破碎，鑒定前需要特殊的前處理方式。使用旋轉培養法進行菌株的液體培養或使用超聲波裂解細胞等改良方法進行前處理可以明顯改善鑒定結果。有研究顯示MALDI-TOF在絲狀真菌菌種水平鑒定的精確率達95.4%。

今年三月有一項研究通過自建旋毛蟲MALDI-TOF數據庫，成功將測試樣本鑒定到種，與傳統方法，充分顯示了MALDI-TOF快速、準確和低廉的特點。這是首次將質譜技術用于食源寄生蟲的鑒定。

今年初有文獻報道在MALDI-TOF MS直接鑒定基礎上，對陽性血培養中常見細菌進行了直接藥敏試驗，其結果與常規藥敏試驗結果高度相符，且直接藥敏試驗的報告周轉時間比常規縮短了24小時。 其它實驗室也有用不同方法直接從血培養瓶檢測細菌，鑒定正確率為31.8%~95%不等。也有研究人員應用MALDI-TOF技術在中段尿樣本中分析細菌蛋白質，從而直接檢測不同種類的細菌，并且對混合感染的樣本有一定的鑒別能力。質譜技術對血、尿標本的直接鑒定可以大幅提高檢測速度，但其推廣還需形成標準化方法。

除鑒定正常的微生物菌群外，MALDI-TOF也被用于耐藥菌株的鑒定。有早期研究發現MALDI-TOF可以將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）與甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）區分開來。另一研究通過檢測頭孢噻肟與69株G-菌孵育后水解產物的量，表明MALDI-TOF在檢測超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的G-菌中具有潛在的臨床價值，今后可在臨床微生物實驗室廣泛開展。也有研究表明，通過agr和sigB調控系統的表達情況，可以評估金黃色葡萄球菌感染宿主的不同狀態，MALDI-TOF質譜技術獲取的m/z特征能夠直觀快捷地判斷這一狀態，該技術的深度應用有待進一步開發。

從2015年開始，國內外陸續有應用MALDI-TOF MS進行聚類分析的報道。它能對多種細菌（大腸埃希菌，肺炎克雷伯氏菌，鮑曼不動桿菌，鼠傷寒沙門菌），甚至耐藥菌（產EBSL的大腸埃希菌，MRSA）進行準確的同源性分析，其結果和PFGE等分型方法較為一致。PFGE的實驗方法操作繁瑣、檢驗周期耗時較長、試劑成本相對昂貴。與之相比，MALDI-TOF MS是一種簡便、快速、高通量的方法。建立MALDI分型的標準化方法對傳染病監測、傳染源追蹤、流行病暴發調查和院感監控等有非常重要的意義。

MALDI-TOF MS在臨床微生物菌種鑒定領域的應用，除了技術本身，更重要的是依賴于質譜菌種鑒定數據庫。數據庫中圖譜的質量、數量都將直接影響鑒定的成功率與準確率。目前的Biotyper和Vitek MS的數據庫中較多是國外菌種，不一定能符合中國臨床的需求。Clin-TOF II的數據庫是在國家疾控中心、軍科院、協和醫院、301醫院、302醫院、微生物所等合作單位的協助下建立的超過2200種，7900株的譜庫，更加適合中國國情。由于病原微生物有地域差別，實驗室在原有數據庫基礎上也可補充建立本地病原微生物的質譜指紋圖譜庫，提高鑒定成功率。

總之，MALDI-TOF MS是一項快速、操作簡單、準確鑒定病原微生物的新型技術。該方法的使用可以優化實驗室檢測流程，節省檢驗時間和成本，將為臨床診治提供很大的幫助，有非常好的應用前景。隨著質譜技術的發展，操作規程不斷規范化，以及病原微生物數據庫的完善，MALDI-TOF方法必將成為新一代臨床微生物鑒定的重要技術。