兩種MALDITOFMS快速鑒定血培養中白念珠菌以外酵母樣真菌

引言

隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用, 念珠菌血癥的發生率在過去10年中已上升了5倍。在美國, 念珠菌已成為院內血流感染第4位的常見病原菌。有研究顯示非白念珠菌在念珠菌血癥的分離率和對抗真菌藥物的耐藥率正逐年上升。因此, 念珠菌血癥早期診斷對患者預后十分重要。但目前臨床微生物實驗室使用的傳統表型生化方法鑒定菌株需要24~48 h, 且準確性不高。使用分子生物學方法如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)等方法鑒定, 費用昂貴, 對操作人員技術要求高, 不能成為實驗室常規的檢測方法。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近幾年發展起來的基于微生物蛋白指紋圖譜鑒定病原菌的方法, 具有快速、準確、靈敏和分辨率高等特點。本研究分析、比較2種不同的MALDI-TOF MS系統以及傳統鑒定方法鑒定血培養中白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定效果。

材料和方法

一、菌株來源

收集2010年10月至2013年1月復旦大學附屬中山醫院住院患者血培養分離到的59株白念珠菌以外酵母樣真菌。所有菌株在SDA(自配干粉購自Oixid公司)培養基分純, 30 ℃培養24 h后備用。

二、方法

1.API 20C AUX 板條鑒定

挑取新鮮菌落制成2麥氏濁度的菌懸液, 吸取100 μ L菌懸液轉入API 20C培養基安瓿內, 然后將安瓿內的懸浮液注入AUC板條的杯內, 30 ℃孵育48~72 h, 讀取鑒定結果。

2.Autoflex MALDI-TOF MS鑒定

根據Bruker Dahonics公司提供的標準操作流程, 先挑取新鮮菌落于500 μ L無菌高效液相色譜級水, 18 759× g離心2 min, 棄上清液。加入1.2 mL 70%乙醇混勻, 18 759× g離心2 min棄上清。加入20 μ L 70%蟻酸全速混勻10 min。再加入20 μ L 100%乙腈, 全速混勻10 min。18 759× g離心2 min后, 取上清液用于MALDI-TOF MS分析。取1 μ L上清液在MALDI-TOF靶板上點樣, 待樣本干燥后, 取1 μ L基質液(50%乙腈和2.5%三氟乙酸的α -氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液)覆蓋于樣本上。樣本和基質液均勻干燥, 將靶板放入MALDI-TOF MS儀, 儀器設定如下:正線性模式, 激光頻率60 Hz, 加速電壓20 kV, 離子源加速電壓16.7 kV、170 BS離子延時引出。每個樣本重復采樣500次, 如未獲合格的圖譜則追加100次, 直至總數達到1 000次。質譜區間設定的質荷比(m/z)為2 000~20 000區域, 波峰的信號強度必須> 0.07。蛋白校準品(大腸埃希菌DH5a蛋白抽提物, 由德國Bruker Daltonics公司提供)單獨點樣作為陽性對照, 基質液為陰性對照。質譜分析:Autoflex MALDI-TOF MS分光計和Flexcontrol 3.0軟件相結合獲取和分析樣本質譜, 應用MALDI Biotyper 3.0軟件將樣本的質譜圖與Bruker Daltonics標準數據庫進行比對。鑒定分值分為0~3, 其中2.000~3.000表示可鑒定到菌種, 1.700~1.999表示鑒定到屬, 0.000~1.699表示不能可靠鑒定。

3.Vitek MALDI-TOF MS鑒定

根據Vitek MALDI-TOF MS標準操作流程, 用1 μ L定量接種環直接挑取新鮮菌落涂在靶板點位內, 先加0.5 μ L Vitek MALDI-TOF MS FA試劑待干燥, 再將標準菌株ATCC 8739(由法國生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校準點位中, 所有檢測位點加入1 μ L Vitek MS-α -氰基-4-羥基肉桂酸基質液, 待干燥后放入MALDI-TOF MS儀器獲取細菌全細胞蛋白質譜, 然后將待測菌質譜和數據庫(MS-IVD數據庫V2.0版本)已知菌質譜進行比較、分析從而獲得鑒定結果。Vitek MALDI-TOF MS結果分為3種顏色:綠色表示唯一的鑒定結果, 可信概率(60.0%~99.9%); 黃色表示低分辨率結果, 可信概率(> 60.0%)需要進一步做補充試驗才能確定; 紅色表示不能鑒定, 可信概率(< 60.0%)與數據庫的任何質譜不匹配^[4]。

4.真菌內轉錄間隔區(internal transcribed spacer, ITS)序列分析

細菌DNA通過酵母基因組DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)提取, PCR擴增引物、反應條件及反應體系見文獻[5]。擴增引物序列為ITS3(5'-GCATATCAATAAGC-GGAGGA-3')和ITS4(5'-GCATCGATGAAGAAC-GCAGC-3')。PCR擴增產物交與北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序, 測序后獲得的序列在BLAST網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行在線比對。

三、統計學方法

使用SPSS 18.0統計軟件進行分析, 選用Fisher Exact Test檢驗統計, 以P< 0.05為差異有統計學意義。

結果

59株真菌經ITS序列分析鑒定, 念珠菌屬53株, 新生隱球菌2株, 異常威克漢姆酵母(Wickerhamomy cesanomalus)2株, 阿薩希毛孢子菌和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)各1株。其中47株經3種系統鑒定結果一致, 包括近平滑念珠菌22株, 熱帶念珠菌11株, 光滑念珠菌8株, 克柔念珠菌2株, 新生隱球菌2株, 季也蒙念珠菌1株和葡萄牙念珠菌1株, 見表1。有12株鑒定結果不一致, 見表2。以ITS序列測序結果為金標準, 3種系統鑒定真菌的準確性分別為:Autoflex MALDI-TOF MS 93.2%, Vitek MALDI-TOF MS 83.1%和API 20C AUX 79.7%, 2種MALDI-TOF MS比較, 差異無統計學意義(P=0.155)。對白念珠菌以外酵母樣真菌的鑒定準確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 100.0%, Vitek MALDI-TOF MS 84.9%和API 20C AUX 84.9%, 2種MALDI-TOF MS比較, 差異具有統計學意義(P=0.006)。其中98.1%念珠菌屬Autoflex MALDI-TOF MS的鑒定值> 2.000, 只有1株克柔念珠菌的鑒定值為1.979。由于Vitek MALDI-TOF MS的IVD2.0數據庫和API 20C AUX菌種庫內沒有包括近平滑念珠菌復合體的其它亞種(Candida metapsilosis和Candida orthopsilosis), 故不能區分“ Candida metapsilosis” 。3種系統對念珠菌屬外的少見真菌(新生隱球菌、異常威克漢姆酵母、阿薩希毛孢子和釀酒酵母)鑒定準確性分別為Autoflex MALDI-TOF MS 33.3%、Vitek MALDI-TOF MS 66.6%和API 20C AUX 33.3%。

表1 3種系統對59株白念珠菌以外酵母樣真菌鑒定的結果

表2 3種系統對12株白念珠菌以外酵母樣真菌鑒定不一致的結果

討論

絕大多數的侵襲性念珠菌血癥是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌引起^[6]。 根據報陽血培養的涂片結果, 使用Chromagar顯色培養基能較好地分離和鑒定白念珠菌, 其準確性> 95%。但是對那些不顯色的非白念珠菌如近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌等, 顯色培養基無法鑒定到種。目前國內臨床微生物室所使用其它系統如API 20C AUX對非白念珠菌的鑒定一般需要18~70 h左右, 時間較長, 并且需要接種米飯培養基等。全自動微生物鑒定儀雖然操作較為簡便, 但也需要16~18 h, 且影響因素較多, 如果不能鑒定, 只能重新操作或選擇其它鑒定方法。隨著近幾年血培養中非白念珠菌分離率、耐藥率的提高及非白念珠菌血癥病死率的上升, 傳統鑒定的方法已經不能滿足臨床醫生及時準確診斷侵襲性非白念珠菌血癥的需求。

近年隨著對細菌蛋白提取和解析技術的發展, MALDI-TOF MS作為一種新技術, 通過提取分析某種微生物特定表型或基因型特征性的生物標志物, 利用已有蛋白質譜指紋圖譜數據庫中的信息對微生物進行的種屬鑒定, 已經在臨床得到越來越多的運用。

本次研究比較目前國際上2家主流的MALDI-TOF MS鑒定系統(Autoflex MALDI-TOF MS和Vitek MALDI-TOF MS)結果發現, 2種MALDI-TOF MS結果對血培養常見真菌的鑒定準確性非常接近(P> 0.05)。但是由于Vitek MALDI-TOF MS系統使用的IVD2.0數據庫沒有包含近平滑念珠菌復合體的其它亞種和季也蒙念珠菌復合體其他亞種的數據。因此, 對于臨床血培養常見的非白念珠菌, Vitek MALDI-TOF MS鑒定準確性遜色于Autoflex MALDI-TOF MS(P< 0.01), 這和臺灣CHAO等報道的結果相似。對于少見酵母菌鑒定的準確性, 由于本次試驗菌株數量較少, 不能做出準確的評估, 有待進一步驗證。使用Vitek MALDI-TOF MS鑒定真菌, 從靶板樣本制備到檢測完畢大約30 min, 而且一次性能夠檢測48株菌, 而Autoflex MALDI-TOF MS由于需要溶菌提取真菌蛋白, 其操作比Vitek MALDI-TOF MS繁瑣、耗時。但2種MALDI-TOF MS鑒定系統均比API系統省時。

綜上所述, MALDI-TOF MS鑒定系統和目前常規生化方法相比, 對多數酵母菌的鑒定具有快速、簡便、準確等優點, 是對傳統微生物檢測方法的補充, 為真菌鑒定提供了新的選擇。隨著質譜數據庫的建立和不斷完善, MALDI-TOF MS技術在真菌以及其它微生物檢測等方面的應用將會更加廣泛。