羅敏敏／龔輝合作組開發神經元稀疏標記方法

　　腦連接圖譜研究是神經生物學主要的研究課題之一。以往研究主要注重于描繪大腦中的不同腦區之間以及不同位置神經元類群之間的連接。雖然這些腦連接圖譜揭示了神經系統的基本結構，但由于缺乏單細胞精度，腦區水平或神經元類群水平的連接圖譜并不能準確反映神經系統的精細結構。目前，有兩個因素限制了單神經元連接譜的研究進展：一方面，為了清晰分辨單神經元的結構，需要對神經元進行稀疏高亮標記；另一方面，需要高精度高通量的成像系統來獲得全腦成像，并需要特殊圖像處理技術進行神經元重構。

　　2018 年11月19日，北京生命科學研究所羅敏敏實驗室與華中科技大學龔輝教授實驗室合作在Nature Methods雜志上在線發表題為Cell type -and Projection-specific Brain-wide Reconstruction of Single Neurons的文章。該研究開發了一套基于腺相關病毒（AAV）載體的稀疏高亮標記方法，并利用此方法實現了全腦范圍單神經元完整重構，以及透明化腦片的中間神經元重構。

　　針對單神經元清晰分辨的問題，羅敏敏實驗室開發了一種基于AAV的表達系統，可以稀疏、高亮地標記特定類型的神經元。這一標記系統由兩個AAV載體兩組成：1）控制子（Controller），由TRE啟動子與Cre依賴的轉錄模塊組成。Cre依賴的轉錄模塊中包含3’-5’反向的FLPo編碼序列；2）放大子（Amplifier），由TRE啟動子和FLP依賴的轉錄模塊組成。FLP依賴的轉錄模塊中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA編碼序列（圖1左）。

圖一 稀疏標記系統工作原理

　　這兩個病毒需混合后進行腦內注射。混合病毒侵染神經元后，若神經元內無Cre表達，則標記不發生。當病毒感染Cre陽性神經元后，控制子中的Cre依賴的轉錄元件會被翻轉。由于此時神經元內沒有tTA表達，TRE啟動子轉錄活性低。在大多數被病毒侵染的Cre陽性神經元中FLPo表達量極低，無法觸發放大子中FLP依賴的轉錄模塊的翻轉。隨機的，在某些Cre陽性神經元中，FLPo表達量達到一定的水平，觸發放大子中FLP依賴的轉錄模塊的翻轉。由于放大子同樣使用TRE啟動子，轉錄活性低，只有少量的GFP和tTA表達。此時，在極少量細胞內tTA的表達量達到一定水平，足以結合TRE啟動子并啟動其后基因的轉錄，正反饋回路被觸發：細胞表達更多的FLPo對剩余的放大子組件進行翻轉，并使更多的GFP和tTA被表達出來，標記強度得到增強（圖1右）。

　　該系統的設計有兩個優點：1）由于標記的觸發依賴于Cre，通過將該稀疏標記系統與Cre轉基因小鼠聯用，能夠實現細胞類型特異性的稀疏標記；2）通過調整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標記的稀疏程度。

　　基于這一標記系統，羅敏敏課題組與華中科技大學國家光電研究中心fMOST課題組合作，建立了“稀疏標記-樣本包埋-fMOST成像-神經元重構-數據校準-量化分析”的流水線，實現了穩定高通量的全腦成像和圖像分析。借助這一流水線，研究人員在DAT-Cre小鼠中重構了15個中腦多巴胺神經元的完整形態。通過單細胞形態學分析，研究人員能夠將重構的多巴胺神經元分為兩類：一類多巴胺神經元只有單個投射目標，軸突在終點處會形成密集的末端樹狀分支（圖二左）；另一類投射軸突分布比較廣泛，會有多個旁分支投向不同目標，少有末端樹狀分支（圖二右）。

圖二 15個多巴胺神經元的全腦投射形態重構

　　研究人員利用不同血清型的AAV病毒，進一步拓展了稀疏標記系統，實現了投射特異性的神經元稀疏標記。利用此方法并結合fMOST成像，研究人員成功對皮層-紋狀體投射神經元進行特異性標記和完整重構（圖三）。

圖三 投射特異性標記策略實現皮層-紋狀體PT/IT神經元完整形態重構

　　組織透明化是近期成像領域屢有突破的技術。研究人員將稀疏標記系統與組織透明結合，在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特異性的標記了兩類中間神經元，制成腦片后用uDISCO方法進行透明化處理。隨后在共聚焦顯微鏡下成像，并對對神經元進行了重構。通過此方法，研究人員實現了中間神經元的快速重構，并且可以高效地對神經元樹突的分支特征進行量化分析（圖四）。

圖四 稀疏標記策略與組織透明結合，實現中間神經元重構

　　該稀疏標記系統的另一大優點是可拓展性高。最初版本的稀疏標記系統中，研究人員利用了Cre和FLP這一對重組酶。通過引入新的重組酶，理論上可以構建與Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏標記系統，以實現在同一樣本內對不同種類神經元的多色標記。為了驗證此策略，研究人員引入了DreO和vCre這一對新的重組酶，構建了DreO/vCre版本的稀疏標記系統（圖五左）。利用Cre/FLP和DreO/vCre兩個版本的稀疏標記系統，研究人員成功實現在同一鼠腦內對兩群神經元進行雙色稀疏標記（圖五右）。

圖五 引入正交重組酶實現多色稀疏標記

　　相比于現有的稀疏標記方法，羅敏敏課題組開發的這一稀疏標記策略具有易使用、易拓展、效率高的特點。除了文章中展示的分子特異性或投射特異性標記，理論上該系統也可以與光遺傳學分子、分子探針、CRISPR/Cas9元件等聯用，用于單細胞水平功能性研究。這一技術的開發將有助于將腦連接譜研究推向單細胞精度，并有希望幫助研究人員在單細胞精度下對正常及病理狀態的神經元進行研究。

　　據悉，羅敏敏實驗室林睿博士、PTN項目博士生王睿宇以及華中科技大學國家光電研究中心袁菁博士為本文的共同第一作者，其他作者包括羅敏敏實驗室馮琦茹、周宥彤，華中科技大學國家光電研究中心曾紹群博士、任淼博士、博士生蔣思齊、倪鴻、周燦。羅敏敏博士及華中科技大學龔輝教授為本文共同通訊作者。