解密神經元：腦連接圖譜走向單細胞精度時代

稀疏標記系統工作原理

15個多巴胺神經元的全腦投射形態重構

　　就像廣袤無垠的宇宙中有無數星體，人類大腦中分布著千億數量的神經元，它們“雜亂無章”地分布且相互連接，發揮著感受刺激和傳導興奮的作用。這些決定人類思考能力的大腦神經元究竟是怎么連接的？這個問題自神經生物學興起以來一直懸而未解。

　　過去，神經生物學家們已經描繪了大腦中不同腦區之間以及不同位置神經元類群之間的連接，但尚未認識到單個細胞精度下的連接方式，這阻礙了對神經系統的精細認識以及一些疾病的精準治療。

　　近日，北京生命科學研究所教授羅敏敏團隊以及華中科技大學教授龔輝團隊合作，完整重構了全腦范圍內單神經元連接圖譜，并獲得了高精度的全腦成像。相關成果發表在《自然-方法》上。

　　從“一團”到單個

　　大腦中的神經元呈“抱團取暖”狀，且“團”的規模稀疏有別，將它們相互連接的是軸突，如電線般又密又細且互相“纏繞”。

　　“要想清晰分辨單神經元的結構，理清哪條‘線’連接哪兩個神經元，需要對神經元進行稀疏且高亮地標記。”羅敏敏告訴《中國科學報》記者。

　　最早的稀疏標記方法是諸如高爾基染色法等的化學法，一直沿用至今，這些方法使人們認識了大腦存在大量且種類不同的神經元。但其缺點在于“一染一大片”，不具有選擇性，無法獲知不同神經元在基因、蛋白等方面的區別。

　　近年來，“玻璃電極”標記法逐漸興起，想要研究某個細胞，就將電極插入該細胞內，注射染料進行標記，但該方法只能“看到一個標記一個”，難以操作且效率低。

　　此外，根據已有的標記方法，科學家們可清楚看到某個腦區神經元細胞“團”的軸突大概伸出的方向，但問題在于每個“團”里還存在著大量不一樣的神經元，它們軸突的特征不清楚。

　　“傳統標記方法呈現的圖譜很粗糙”，論文第一作者、北京生命科學研究所博士林睿形象地舉了個例子，“就像我們知道可以開車從北京A地到B地，但實際上兩地之間有許多不同的路，有的遠，有的近。”

　　為何要執著于描繪單細胞精度的連接？林睿同樣以路類比，“從A地到B地，整體上看不堵車，但實際有些路非常堵。同樣地，在進行神經退行性疾病檢測時，大范圍看，1萬個神經元細胞好像沒什么問題，但其中的100個細胞很可能已經有早期的病變現象，而傳統方法無法捕捉到這些信息。”

　　林睿還提到，目前神經生物學研究大多通過大腦切片的方式，只能看到單個神經元細胞的部分形態而非全貌，解決該問題還需要高精度高通量的自動化光學成像系統來獲得全腦成像，從而進行神經元細胞的完整重構。

　　特異性標記：“指哪打哪”

　　在對神經元的研究中，稀疏特異性標記與高亮度成像兩者同時實現，一直是難以跨越的“鴻溝”。

　　“特異性選擇是為獲得我們感興趣的神經元細胞，它們對某些行為或病理有某些特定的功能，而高亮成像是為了在光學顯微鏡下更清晰地看到軸突延伸的方向以及長度”，林睿說。

　　為解決這一矛盾，研究人員引入了兩個腺相關病毒（AAV），一個名為“控制子（Controller）”，負責控制降低標記細胞的個數；另一個名為“放大子（Amplifier）”，負責增加標記亮度。將兩個病毒混合后注射到小鼠腦內感興趣的細胞上，混合病毒便會侵染神經元，進行特異性標記。通過調整“控制子”和“放大子”的混合比例，控制標記的稀疏程度。

　　利用基于兩個腺相關病毒的稀疏標記系統，羅敏敏課題組與華中科技大學國家光電研究中心fMOST課題組合作，借助其熒光顯微光學切片斷層掃描平臺，建立了“細胞特異性稀疏標記—高分辨率全腦形象-神經元形態學重建-量化分析”的流水線，實現穩定高通量的全腦成像和圖像分析。

　　在這一流水線上，研究人員在3個DAT-Cre小鼠中重構了15個中腦多巴胺神經元的完整形態。經分析，研究人員認為重構的多巴胺神經元有兩種投射模式：其中10個多巴胺神經元軸突只有單個投射目標，它們在終點處會形成小而密集的末端樹狀分支；另外5個則分布更為廣泛，會有多個分支投向不同目標。

　　共享開放的平臺

　　“大腦是復雜的，神經生物學的研究越來越細化。這項研究讓我們對單個神經元細胞的特異性信息有了一個更清晰的認識。”他們在研究中專門考慮到標記方法的兼容性，使用了轉基因小鼠，這適用于幾乎所有大腦區域的大多數主要細胞類型。

　　這樣做的好處在于，如果其他研究人員想用這個方法，用他們感興趣的轉基因小鼠，直接用這兩個病毒來標記他們想要研究的神經元即可。

　　羅敏敏告訴記者，不同研究人員可利用這個方法對小鼠的各個腦區不同神經元進行普查，建立單細胞精細結構基礎數據庫，“這樣，我們可以了解帕金森、阿茲海默等病癥發病的早中晚期在單個細胞形態上的變化。”

　　未來，他們期望這一稀疏標記系統被更多感興趣的研究者所使用，“大腦神經元太多了，不是我們重構一、兩千個就夠了，需要更多的人來做，同時結合算法把數據處理的效率提上去。”林睿說。